什么是Safe Harbor？

20 世纪 90 年代末 Philipe Soriano 及其同事发现，一个被命名为 ROSAβgeo26 的随机转基因小鼠品系在所有组织中都能检测到高水平的β半乳糖苷酶表达。他们对这种转基因小鼠进行了基因插入的定位，确定了在第6号染色体的基因整合，也就是我们现在常说的Rosa26位点。虽然带有外源插入片段的纯合子小鼠的出生率略低于杂合子幼崽，但纯合子小鼠也能正常发育和繁殖，对小鼠和细胞无害。自此，Rosa26位点被用于基因安全敲入并能保证转入基因的正常稳定表达。「Safe Harbor 」安全港位点的概念由此被普及。

除了Rosa26以外，还有哪些位点可以安全地进行外源基因插入并高效表达呢？

已经有多个可用于哺乳动物外源基因插入的基因组「Safe Harbor」被发现并应用到人、小鼠、大鼠、兔子、猪的可调控或可逆基因过表达，例如：AAVS1、CCR5、HPRT、H11、Col1a1、TIGRE等等。

H11位点

H11位点（也叫Hipp11）位于小鼠第11号染色体，是 Eif4enif1与Drg1 这两个基因之间的一个位点，由 Simon Hippenmeyer于2010 年发现并命名。由于H11位点位于两个基因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。同时H11位点所在的Eif4enif1与Drg1这两个基因的侧翼序列区域具有广泛的空间和时间EST（expression sequence tag）表达模式，能够使整合在此的外源基因受指定启动子的驱动而稳定表达。该位点的纯合敲入小鼠可正常发育和繁殖。因此成为可与Rosa26位点相媲美的新「Safe Harbor」。

和Rosa26位点的过表达模型一样，在H11位点我们也可以采用CRISPR/Cas9技术构建条件性基因过表达小鼠模型，即广泛型强启动子pCAG与外源目的基因cDNA之间用loxP-STOP-loxP结构隔开，只有与组织特异性Cre工具鼠交配后，才会在特异细胞或组织中表达目的基因。

Col1a1位点

Col1a1位点是2006年由Caroline Beard首先使用作为四环素诱导调控外源基因表达的整合位点。Col1a1位点实际上位于第11号染色体的Col1a1基因3‘UTR下游约500bp左右。在四环素调控模型中，在TetO启动子之前往往加上SA-polyA来阻隔上游启动子的影响，防止不依赖于四环素的转录调控。

图3. Col1a1定点插入位点示意图。

图4. Col1a1位点四环素调控可逆过表达模式图。

例如，Col1a1-tetO-EGFP与Rosa26启动子驱动的rtTA工具鼠交配后，通过dox诱导，在小鼠体内可高效诱导EGFP的表达，且EGFP的表达谱与Rosa26启动子表达谱相一致。不过值得注意的是，在骨骼肌、脑组织和睾丸组织中没有EGFP的表达，后两者可能是由于血脑屏障和血睾屏障的关系。

图5. Col1a1位点dox诱导EGFP表达情况。

图6. Col1a1位点dox诱导EGFP表达概况表。

TIGRE位点

TIGRE是tightlyregulated 的缩写，也是一个适用于四环素调控的整合位点，位于小鼠第9号染色体AB124611 和 Carm1两个基因之间。

TIGRE-TetO-LacZ与MMTV-tTA工具鼠交配后，在大多数主要组织脏器中，都可以检测到报告基因LacZ的表达。

和Col1a1位点类似，最好在TetO-cDNA-polyA两侧加上隔离子来减少不依赖于四环素的本底表达。

好的，常用的定点整合位点（Safe Harbors）先给大家普及这么多，如果想要了解更多可以在下方留言区互动，也可在公众号内回复「学问」，查看更多小鼠大学问系列干货！

References

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