FAQ

Cre-ERT2小鼠是一类含有雌激素受体（estrogen receptor，ER）的配体结合区突变体（ERT）与Cre重组酶的融合蛋白表达的小鼠。Cre-ERT2在无Tamoxifen诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT（雌激素类似物）与ERT结合，可使Cre-ERT2进核发挥Cre重组酶活性。

Tamoxifen给药建议如下：

1. 他莫昔芬的配置和储存
他莫昔芬不溶于水，一般建议用玉米油溶解：可按照20mg/ml的终浓度进行配置，37℃摇晃过夜。由于玉米油太多会导致他莫昔芬溶解度变差，所以建议一次配置50mL以内的他莫昔芬溶液，配置完成后分装成1mL每管，-20℃避光保存，使用时避免反复冻融，正常半年内都是可以使用的。此外，他莫昔芬对光敏感，在制备和储存过程中需要注意避光处理。

他莫昔芬和玉米油的品牌较多，我们常用的如下，仅作参考：

Tamoxifen
(Sigma‐Aldrich)：CAS # 10540-29-1


玉米油 (Sigma‐Aldrich) CAS# 8001-30-7

2. 他莫昔芬的给药剂量及频次

对于成年小鼠（4周龄以上），他莫昔芬的推荐剂量为75mg/kg-120mg/kg。120mg/kg是我们现在使用比较普遍的一个剂量，一般注射3-5次（我们常用5次），隔天一次；75mg/kg是我们做过的最低剂量，但是给药需要持续5次。幼鼠剂量可以降到100mg/kg。孕鼠及老龄鼠（大于6月龄）的剂量也需要适当减少。

3. 他莫昔芬的给药方式

他莫昔芬可以通过腹腔注射、灌胃、饮食或饮水等途径给药，应用最广泛的是腹腔注射给药，腹腔注射的给药剂量精准，便于控制。

腹腔注射给药流程：正确抓取小鼠，将小鼠的鼻子朝向地面，露出腹部；定位动物的中线并将腹部分成四个象限，特别是动物的右下象限，是腹腔注射的合适位置（右下象限缺少重要的解剖结构）；多次腹腔注射时，应交替注射部位。

注：Tamoxifen会影响胎儿发育和生产，孕鼠诱导的时间尽量选择孕晚期，并同时注射孕酮来减少流产概率。

灌胃给药的给药剂量和频率与腹腔注射相同，在正式实验前，建议同学们先反复练习，熟练掌握灌胃给药的技巧。

饮食/饮水给药使用较少，主要是他莫昔芬水溶性差，小鼠的给药剂量不好量化，且需要的诱导时间较长（一般需要几周进行诱导），在诱导期间往往还伴随着小鼠体重的下降（约10-15%）。

4. 注意事项

A. 他莫昔芬注射完成后不建议立刻开展实验，一般来讲，停药后需要继续饲养7天，再安排后续实验。

B. 对照组小鼠需要同步进行不含他莫昔芬的玉米油溶液给药。

C. 未处理的小鼠需要和注射他莫昔芬的小鼠分笼饲养，小鼠舐舔到他莫昔芬悬液，梳毛等行为可能导致意外敲除。

D. 加热不会导致Tamoxifen失效，37℃过夜溶解他莫昔芬是没有问题的。

最后，不同的实验方案、不同的小鼠品系、不同的组织器官等对于给药剂量、给药频率和给药方式等的要求往往是不同的，因此，上述方法只是一个参考，面对具体实验时，同学们还应根据参考文献、实验经验先进行预实验，以确定最佳方案。

参考文献：Feil S, Valtcheva N, Feil R. Inducible Cre mice. Methods Mol Biol. 2009;530:343-63.  doi: 10.1007/978-1-59745-471-1_18. PMID: 19266339.

基因工程小鼠的命名规则

有没有发现，当你在查询或看paper时，往往会蹦出几个贼长的，还夹杂着数字、上标、符号的名称，比如：129-Trp53^tm1Holl/J、FVB-Tg(PomcCre)5Brn...... 看上去很复杂的样子。这些其实是基因工程小鼠的全名。

如果把这一长串字符解构一下，常见的基因工程小鼠可以分为两种命名方式：

• 基因定点修饰的小鼠命名，比如：敲除、敲入、点突变等等。

• 随机转基因的小鼠命名

基因定点修饰小鼠的命名

这一类小鼠的名称基本长这样：

下面我们对这些组成部分逐一说明~

品系背景

如果是在单一的小鼠背景上完成的基因修饰，并且在繁育过程中未引入其它品系，那么就可以以品系全称来表示。比如：

如果是在混合品系背景上，那么可以用这几个品系（<3个）缩写，并以分号作为间隔。分号前表示受体，分号后表示供体。比如：在一个来自C57BL/6与129杂交 ES 细胞系上定点敲除某个基因，就可以用B6;129表示。直至这个品系与 C57BL/6 小鼠回交至近交系程度，那么可以改写为B6.129。

如果供体品系是混合背景或有未知来源，那么回交至受体品系的近交系程度后，可以用.Cg来表示，比如：B6.Cg。

如果存在3个以上祖系或有未知来源的混合遗传背景，那么以STOCK来表示。

被修饰的基因

这里的基因名用的是 Gene Symbol。Gene Symbol 和 Gene Name 到底有什么区别呢？

Gene Symbol 有以下特点：

• 物种中唯一的

• 短，3-5个字母，最多不超过10个字母

• 只用罗马字母和阿拉伯数字

• 大写字母开头，后跟小写字母或数字

• 不包括组织特异性或分子量

• 最好跟 Gene Name 的首字母一致

• 斜体表示

• 不同物种的同源基因使用相同的 Gene Symbol

Gene Name 则一般有以下特点：

• 简短，可以是几个单词，包含基因功能或特点

• 首字母小写（人名或专有名词除外）

• 使用美式拼写方法

举个例子你就明白啦，例如：

Shh 是 Gene Symbol，而 sonic hedgehog 则是它的 Gene Name。

所以，如果你想查找某个基因的敲除品系，那么最好输入 Gene Symbol，而不是 Gene Name 或者曾用名。

这里特别提一下定点过表达的这类情况：

目前最常用的两个定点过表达的整合位点，一个 Rosa26位点，一个是 H11位点。

• Rosa26是一个基因，所以可以用它的 Gene Symbol，也就是 Gt(ROSA)26Sor。

• H11并不是某一个特定基因，而是存在于两个基因之间的一个特定染色体位置，所以没有 Gene Symbol。目前公认的命名是 Igs2，表示 intergenic site 2 的缩写。

修饰方式^（上标）

tm：对于 ES 细胞打靶途径获得品系，用 tm 表示 targeted mutation。

em ：对于 CRISPR/Cas9 或 TALEN 等核酸酶系统介导的基因修饰品系，用 em 表示 endonuclease-mediated mutation。

编号^（上标）

这里的编号是指在该实验室中，对该基因修饰的序列号。

例如：Trp53^tm1Holl表示在Holl实验室对Trp53基因进行的第一次突变。

有时候会看到 tm1.1、tm1.2的情况，这是指条件性基因敲除（CKO）小鼠在与生殖系重组酶工具鼠交配后获得的子代小鼠品系，为了与亲代 CKO 小鼠（编号为 tm1）区分。而亲代 CKO 小鼠与其它组织特异性重组酶工具鼠交配的子代就不单独命名了。

插入结构^（上标）

对于基因敲除和条件性基因敲除，在命名中一般不加入插入结构的部分，即编号后紧跟实验室代号。

例如：Trp53^tm1Holl。

如果有敲入的基因，可以在括号内写出插入的外源基因。

例如：Cd19^{tm1(cre)Labcode}表示在 Cd19基因中敲入 Cre基因。

如果敲入的是 RNAi，那么把RNAi针对的靶点写进括号中。

例如： Gene^{tm#(RNAi:Il23a)Labcode} 。

实验室代号^（上标）

一般实验室代号是机构名称的首字母缩写。

比如：

J 表示 The Jackson Laboratory；

Kyo 代表 Kyoto University ；

Smoc 代表上海南方模式生物；等等。

随机转基因小鼠的命名

这一类小鼠的名称基本长这样，命名中Tg代表 Transgene。

转入基因

在括号中填入转入的基因的启动子信息以及 Gene Symbol。

编号

指该实验室制备的转基因 founder 编号或系列编号。

如果使用转座子系统来制备转基因小鼠的话，那么命名时在 Tg 后面加上 Tn，表示 transposable element。随后的括号内，一般需要包括：所使用的转座子系统缩写，以及构建的载体结构，两者用“-”链接：TgTn(transposon_class_abbreviation-vector)#Labcode。

例如：B6.Cg-TgTn(sb-lacZ,GFP)IF2Jtak/JtakRbrc，其中 sb 是 sleeping beauty的缩写。

知道了基因工程小鼠的命名规则，你可能又要问了，名字这么长总不能每次都写全名吧？确实，通常在文章中对所用的基因工程小鼠进行表述时，我们可以采用简写的方式。具体可以怎么写呢？

基因工程小鼠的一般简写方式

基因敲除

大家很熟悉了，可以分别用加、减号上标来表示 wildtype allele 与 mutant allele：

• KO 纯合子 Gene^-/-

• KO 杂合子 Gene^+/-

• 野生型对照 Gene^+/+ 或 WT (wildtype)

基因敲入

将敲入的元件写在上标里，例如：

• Shh 基因 E177A 点突变杂合子：Shh^E177A/+

• 如果 Shh 基因敲入报告基因或Cre重组酶基因，可以写成 Shh^EGFP/+，或者也可以直接写成 Shh-EGFP、Shh-Cre。

转基因

一般直接写出表达的基因结构，例如：

• Villin promoter 驱动 EGFP 报告基因的转基因小鼠就可以表示为 Vil-EGFP。

条件性基因敲除

将 flox 作为上标表示，比如：

• CKO 纯合子 Gene^flox/flox 或 Gene^f/f

• CKO 杂合子 Gene^flox/+ 或 Gene^f/+

如果与广泛表达 Cre 或生殖系表达 Cre 工具鼠交配后获得了全身敲除的小鼠，那么可以按 KO 小鼠的规则来简写。

如果与组织特异性 Cre 小鼠交配，那么可以组合写成：Gene^flox/flox；Cre。

如果文章中只用到一种组织特异性 Cre 工具鼠，也可以按 KO 的方式简写，即 Gene^-/- 可以表示 flox 纯合子且 Cre 阳性小鼠。

如果有多种不同的 Cre，那么就需要分别表示了。

例如：Tlr5 flox 小鼠分别与小肠上皮细胞（IEC）特异性 Cre（Vil-Cre）、 DC 细胞特异性 Cre（CD11c-Cre）交配的子代中发生基因敲除的纯合子小鼠可以分别表示为 Tlr5^flox/flox；Vil-Cre 和 Tlr5^flox/flox；CD11c-Cre。如果觉得这样写太麻烦，也可以这样表示：Tlr5^ΔIEC 和 Tlr5^ΔDC。

关于基因工程小鼠的命名原则大致先介绍到这里，使用基因工程小鼠的过程中有任何问题，欢迎与我们沟通。

技术热线：400-728-0660

邮件咨询：tech@modelorg.com

国际业务：service.us@modelorg.com

一般可通过PCR+ 测序方法进行基因型鉴定。示意图如下：

图10. A. 野生型小鼠PCR 产物测序峰图。B. 阳性F0 代小鼠基因型鉴定PCR 产物测序峰图。CRISPR/Cas9 作用后，由于发生同源

重组修复(HR) 的同时，也可能发生非同源重组修复(NHEJ)。因此，切点附件可能出现杂峰现象。C. 阳性F1 代小鼠基因型鉴定PCR

产物测序峰图。阳性F1 小鼠基因组一个拷贝是野生型，一个拷贝是突变体，在Cas9 作用位点附近区域测序，突变点位置有双峰现

象（野生型和突变体，两种基因型产生了两种峰型）。C’ 和C” 为C 图测序PCR 产物链接T-vector 后，单克隆测序结果。其中，C’

为野生型，C” 为突变体。峰型对比可以发现C” 较C’ 的目的突变点CCT 突变为GTT，C’ 和C” 峰型结果可以和C 图峰型结果相吻合。

对于NHEJ 随机修复获得的基因敲除小鼠，一般可通过PCR+ 测序方法进行基因型鉴定。示意图如下：

图9. A. 野生型小鼠PCR 产物测序峰图。B. 阳性F0 代小鼠基因型鉴定PCR 产物测序峰图。CRISPR/Cas9 作用后，由于发生NHEJ

随机修复，产生多种基因型，在Cas9 切点附近出现杂峰现象。C. 阳性F1 代小鼠基因型鉴定PCR 产物测序峰图。阳性F1 小鼠基因

组一个拷贝是野生型，一个拷贝是突变体，在Cas9 作用位点附近区域测序有后双峰现象（两种基因型产生了两种峰型）。C’ 和C” 为C. 图

测序PCR 产物连接T-vector 后，单克隆测序结果。其中，C’ 为野生型，C” 为突变体。峰型对比可以发现C” 较C’ 缺失了两个碱基

CC。C’ 和C” 峰型结果可以和C 图峰型结果向吻合。

引物设计可参考以下图示方案。

图8. A. 鉴定Flox 小鼠中Neo 基于是否去除；B. 鉴定在特定组织中目的基因是否被敲除。

引物设计可参考以下图示方案。

图7. A. 基于ESC 打靶的三引物鉴定方案；B. 基于ESC 打靶的二引物鉴定方案；C. 基于CRISPR/Cas9 的鉴定方案。

在进行基因型鉴定PCR 时通常采用粗抽提的方法从鼠尾组织中提取基因组DNA，这类抽提方法获得的基因组DNA 含

有较多杂质，可能会影响后续PCR 的效率。可以考虑优化抽提方法，保证基因组DNA 质量。在PCR 反应体系中，基

因组DNA 的浓度也会影响PCR 的效率。基因组DNA 过多或过少都有可能导致PCR 扩增失败。可以考虑调整PCR 反

应体系。若PCR 鉴定出现非特异性条带，可以考虑提高退火温度，以提高引物的特异性结合。

基因工程小鼠基因型PCR 鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组

DNA 为模板进行PCR，并以凝胶电泳比对比不同基因型特异产物的大小，根据条带大小来区分小鼠的不同基因型。

研究表明小鼠模型中Cre 表达也会有毒副作用，例如不育和存活力降低。某些品系的Cre 纯合子小鼠尤其是这样。

Cre 活性过高可能引起在基因组中未知的loxP 位点重组，从而引发敲除或移位进而影响小鼠存活。另外，在通过显微

注射获得的Cre 转基因品系中，Cre 基因插入可能干扰某些重要內源基因的功能。

已研究的大部分品系中，Cre 表达与从哪个亲本遗传的Cre 基因无关。但对某些品系而言，从母本遗传Cre 基因的小

鼠相较于从父本获得Cre 基因的小鼠，其Cre 重组效率更高，例如EIIa-Cre 品系。