超详细！荧光蛋白大盘点

之前我们介绍了绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP），不知道大家还有没有印象呢？（点击查看：一文揭秘！绿色荧光蛋白的前世今生）

自1962年GFP被发现以来，科学家们对荧光蛋白更深入的探索和应用从未停止。通过一系列的探索，各种不同波长的突变体荧光蛋白现世，大大扩充了荧光蛋白的品类，满足了科学家们在不同课题中的需求，并且在蛋白标记、体内示踪等方面得到了广泛应用。

之前我们也介绍过GFP经过改造后产生的不同颜色突变体，如黄色突变体（EYFP）、蓝色突变体（EBFP）等。今天，小编就带大家仔细了解一下这两种突变体及其他荧光蛋白。


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图1 各色荧光蛋白生物成像图

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蓝色荧光蛋白

增强型蓝色荧光蛋白（EBFP）有四个氨基酸突变，它的激发波长为380nm，发射波长为440nm。突变后的EBFP虽然在蛋白折叠及发色团形成效率方面得到了改善，使其所发出的荧光亮度与BFP相比有所增强。但EBFP的荧光整体仍较弱，与野生型GFP荧光强度相近，成像时背景信号较高。

因此针对其研发出了3个更亮的荧光突变体：Azurite、EBFP2和mTagBFP，它们的亮度分别是EBFP的1.6倍、2倍和3.7倍。其中，mTagBFP是由红色荧光蛋白TagRFP突变而来的。


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图2 成纤维细胞 （皮肤细胞）用荧光染料标记（图片来源于包图网）

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黄色荧光蛋白

增强型黄色荧光蛋白（EYFP）是最早的黄色荧光蛋白突变体，有四个氨基酸发生突变，使得EYFP的发射光变为黄绿色，且荧光强度与EGFP荧光强度相似。不过EYFP虽已被广泛应用，但它本身存在一些缺陷导致其并非最理想的荧光蛋白。

目前，mCitrine和mVenus在EYFP基础上改进的黄色荧光变体应用较为广泛。另外，还有一种经合成的DNA重排获得的能量转移黄色荧光蛋白YPet，亮度在黄色荧光蛋白中是最强的，且光稳定性较强。同时，YPet比mVenus或者其他荧光蛋白对于酸性环境的耐受能力更强。


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图3 纺锤体中 YFP 表达的焦点成像（PLoS One. 2015;10(3):e0119538.）


对于细胞、组织来说，长波长光子的激发产生的光毒性更小，且动物组织光吸收和自体荧光也更小。因此，红色的荧光基团因其较低的背景可以表现出更高的对比度，更适合于体内成像。这使得荧光蛋白的改造慢慢向红色偏移。

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红色荧光蛋白

红色荧光蛋白在1999年首次被报道，与绿色荧光蛋白GFP一样，红色荧光蛋白（DrFP583）也是从珊瑚虫中克隆的一种荧光蛋白，在紫外光激发下可发射红色荧光。

红色荧光蛋白的激发和发射波长较GFP相比要更长，成像时背景更低，且可与GFP共用，因此有较大应用前景。但由于DrFP583易寡聚化、成熟缓慢等缺陷限制了它的应用。因此通过对它进行改造，得到了寡聚化程度更低、成熟速度更快的突变体DsRed。另外，还有红色荧光突变体：mCherry、DsRed、tdTomato和mStrawberry等。

  • mCherry具有优异光稳定性，是最通用红色单体（但融合表达时有较弱的齐聚效应）

  • tdTomato具有mCherry相同的光稳定性，亮度更强，是追踪表达水平的理想选择，但为串联二聚体，可以在融合标签大小不干扰蛋白质功能的情况下使用

  • mStrawberry是最亮的红色单体，但光稳定性要弱于mCherry

  • DsRed是细胞毒性最小的RFP

  • mApple在蛋白的融合表达中是mCherry理想的替代物，但其光稳定性要远弱于mCherry

  • mKate2从参数方面考量是综合亮度、光稳定性和齐聚性的最佳RFP，但目前报道相对较少


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图4 基于双同源重组系统的BASCs遗传谱系示踪（Nat Genet. 2019;51(4):728-738. ）

南模生物自主研发多种荧光蛋白工具鼠，即在目的基因的特定位置引入报告基因（包括荧光蛋白，如EGFP、mYFP等）或标记基因的小鼠模型（部分小鼠模型见下表），与特定重组酶工具鼠杂交，可以实现在特定细胞类群标记出所需荧光，帮助蛋白标记、谱系示踪等实验顺利进行。如您有相关需求，欢迎拨打400-728-0660或者关注微信公众号点击在线咨询，我们的专业团队将竭诚为您服务！


表1：部分荧光蛋白工具鼠

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Reference：

[1] Kremers, G. J., Goedhart, J., van den Heuvel, D. J., Gerritsen, H. C., & Gadella, T. W., Jr (2007). Improved green and blue fluorescent proteins for expression in bacteria and mammalian cells. Biochemistry, 46(12), 3775–3783. https://doi.org/10.1021/bi0622874

[2] Zeini, D., Glover, J. C., Knudsen, K. D., & Nyström, B. (2021). Influence of Lysine and TRITC Conjugation on the Size and Structure of Dextran Nanoconjugates with Potential for Biomolecule Delivery to Neurons. ACS applied bio materials, 4(9), 6832–6842. https://doi.org/10.1021/acsabm.1c00544

[3] Shimozono, S., & Miyawaki, A. (2008). Engineering FRET constructs using CFP and YFP. Methods in cell biology, 85, 381–393. https://doi.org/10.1016/S0091-679X(08)85016-9

[4] Tang, M., Teng, P., Long, Y., Wang, X., Liang, L., Shen, D., Wang, J., & Zheng, H. (2018). Hollow carbon dots labeled with FITC or TRITC for use in fluorescent cellular imaging. Mikrochimica acta, 185(4), 223. https://doi.org/10.1007/s00604-018-2761-2

[5] Smale S. T. (2010). Luciferase assay. Cold Spring Harbor protocols, 2010(5), pdb.prot5421. https://doi.org/10.1101/pdb.prot5421

[6] Li, Y., Sierra, A. M., Ai, H. W., & Campbell, R. E. (2008). Identification of sites within a monomeric red fluorescent protein that tolerate peptide insertion and testing of corresponding circular permutations. Photochemistry and photobiology, 84(1), 111–119. https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2007.00206.x

[7] Chopra, A. (2008). Gaussia princeps luciferase. In Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). National Center for Biotechnology Information (US).



关于我们


上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。




审核：趣多多/寻行鼠墨

编辑：方知有



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