图2. 谱系追踪策略^[3]

自 1990 年代初以来，基因重组技术一直用于细胞谱系追踪，目前已经成为了大多数谱系示踪研究的首选方法。目前，体内的遗传细胞追踪技术主要基于 Cre-loxP 、 Dre-rox 、 FLP-FRT 等同源重组系统，利用细胞或组织特异性表达的重组酶，特异性激活条件报告基因的表达，从而实现标记细胞所有后代的永久遗传标记。

图3.Cre-Loxp系统示意图^[2]

小鼠的遗传谱系追踪最常使用的是Cre-loxP系统，而为实现重组的时间与空间的双重控制，又进一步开发了CreERT2-loxP系统，可使用他莫昔芬进行诱导重组，从时间上调控介导Cre-loxp重组。这种方法也被称为诱导性Cre重组酶。

图4.CreERT2示意图^[2]

根据重组类型和数量，基因重组系统可以分为传统的单重组酶介导的遗传方法与更复杂的多重组酶介导的遗传方法。

根据细胞标记所需的荧光报告基因数量，单重组酶类型可进一步分为单色报告基因和多色报告基因。常用的报告基因包括Rosa26-tdTomato、Rosa26-LacZ、Rosa26-GFP 和 Rosa26-YFP等。

图5.单重组酶介导的基因重组系统^[3]

单色报告基因就是最基础的使用Cre-loxp系统进行谱系示踪，该技术的关键在于评估驱动Cre的启动子的表达位置。而Cre-loxP系统的多色报告基因可用于单细胞标记和克隆分析，为单细胞增殖、分化后的命运提供了有价值的信息。这种报告系统也被称之为“Brainbow”系统。

在 Brainbow 系统中，Cre/lox重组可在三种或更多荧光蛋白（XFP）之间随机选择表达，从而提供了一种区分相邻神经元和可视化其他细胞相互作用的方法。根据lox 位点不同还可以分为Brainbow-1 与Brainbow-2。

Brainbow-1 在成对不同的 lox 位点之间使用 Cre 介导的切除，实现不同的基因重组。Lox变体不会与经典 loxP发生重组，但可以与相同的Lox变体发生重组。利用这一特性，Brainbow-1通过在同一结构中交替使用变异 lox 位点和经典 loxP位点，cre酶会在任意一对相同的lox位点之间进行切除，同时去除另一对位点中的一个，从而防止进一步的重组。

图6.Brainbow-1：使用不相容的lox变体进行随机重组^[4]

在 Brainbow-2 中，Cre 以相反的方向反转由 loxP 位点分隔的 DNA 片段以产生多个重组结果。当两个loxP为反向时，Cre 可以反转中间的 DNA 片段。只要重组酶存在，倒转就可以持续。而通过限制Cre酶的活性时间，就可以实现细胞中基因的稳定重组。

图7.Brainbow-2：利用 Cre 介导的反转进行随机重组^[4]

使用 Brainbow系统对小鼠特定组织的单细胞进行标记后，即可根据颜色对终点细胞进行分组，从而实现单细胞水平的谱系谱系示踪。

如果没有特定细胞类型特有的基因，则无法通过常规方法对其进行特异性标记。此外，在一个细胞群中靶向两个基因启动子可能比依赖传统报告系统中常用的单个启动子更精确。

控制由两个启动子驱动的受限制报告基因表达需要两种不同的重组酶系统，例如Cre-loxP、Flp-frt、Dre-rox 和 Nigri-nox等。目前已经开发了多种双重组酶介导的遗传标记系统，以增强特异性和同时标记的细胞类型数量，目前常见的可分为交叉报告基因类型、独家报告基因类型和嵌套报告基因类型。

图8.多重组酶介导的基因重组系统^[3]

为了精确标记一个细胞群，有时使用两个细胞特异性maker来定义细胞群（如下图A）。细胞特异性makerA与细胞特异性makerB双阳性的细胞，才会被特异性标记。

下图中就是通过两个细胞特异性标记特异性标记了细支气管肺泡干细胞 （BASC）。BASC是位于细支气管肺泡管交界处的多能干细胞，它们共同表达细支气管细胞标志物 Scgb1a1（也称为 CC10）和肺泡2型细胞标志物 Sftpc。由于缺乏专门定义BASCs的单一最佳标记基因，无法使用传统的Cre-loxP介导的谱系追踪方法追逐BASCs的分化命运，而通过双标志物就可以特异性地追踪Scgb1a1 +Sftpc+ BASC。

图9.单色交叉报告基因系统^[3]

为了通过使用其他颜色同时对多种细胞类型（细胞群及其亚群）进行遗传标记，交叉遗传报告基因系统会结合两个或多个报告基因。如下图中，特异性makerA阳性的细胞会被标记为红色，特异性makerB阳性的细胞会被标记成绿色，而makerA、B双阳性的细胞由于同时表达红色与绿色荧光而被标记为黄色。这样可以通过不同的颜色准确区分不同来源的细胞，增强对细胞群命运可塑性的理解。

图10.多色交叉报告基因系统^[3]

通常，细胞类型中基因的激活不是“有”或“无”，特定的基因标记意味着启动子的活性在这种细胞类型中相对较高，而在其他细胞中，目的启动子也可能被弱激活，这种现象也被叫做异位表达。异位表达对谱系追踪的影响很大，常常会导致一些关于细胞命运的争议。

以 c-kit 基因为例，既往研究报道 c-kit+细胞是心肌细胞祖细胞，可能有助于心脏损伤后的新心肌细胞生成。然而，随后的研究表明，c-kit基因也在极少数心肌细胞中表达，表明心脏损伤后追踪的心肌细胞可能是先前标记的c-kit+心肌细胞。

想要明确这类问题，就可以使用独家独家报告基因系统。这类系统是利用两个重组系统，将两对识别位点错落的分布在两个报告基因两端。如果首先发生一个重组，则相应报告基因的表达将去除另一个重组系统的一个识别位点。换句话说，这个系统会防止同一细胞中发生二次重组。

同样以c-kit 基因为例，我们需要特异性靶向的c-kit+非心肌细胞，追踪其分化命运，才能得出正确的结论。因此，我们可以使用心肌细胞特异性标记工具Tnni3-Dre将心肌细胞进行标记，之后再对c-kit+细胞进行标记，此时标记的细胞即为c-kit+非心肌细胞。

图11.独家报告基因系统^[3]

在遗传谱系追踪实验的设计过程中，当特定细胞类型的定义依赖于阳性和阴性标记物（如A+B-细胞）时，只使用Cre-loxP 策略只能标记所有 A 细胞，包括“想要的”细胞类型（如A+B-细胞）和“不需要的”细胞类型（如A+B+细胞）。在这种情况下，我们可以利用双嵌套报告系统来精确区分这些不同的“想要的”和“不需要的”细胞类型。

以下图为例，在使用 NR1 的方法中，启动子 A 介导的 Cre-loxP 内部重组可能导致细胞 A 呈绿色。然而，如果启动子A在“不需要的”细胞B（A+B+细胞）中也被激活，由于B类型细胞中特定启动子B驱动的外部Dre-rox重组已经去除ZsGreen基因，因此这部分“不需要的”细胞B（A+B+细胞）仍呈现红色。

这种方式较独家报告基因系统的优势是Dre-rox 和 Cre-loxP 的重组顺序不会影响最终结果，这是由 Cre 和 Dre 的表达决定的。因此，嵌套报告系统可用于破解一些定义具有已知阳性和阴性标志物特异性表达的干细胞的细胞命运。

图12.嵌套报告基因系统^[3]

多重组酶介导的遗传方法增强了细胞命运图谱的特异性和精确性，从而可以在生物过程中发现前所未有的细胞事件。策略的选择主要取决于基因表达、可用的小鼠工具和要解决的科学问题。我们还可以结合实时成像更全面地观察细胞行为。新的遗传系统还可以与CRISPR-Cas9介导的条形码相结合，为单细胞命运研究提供更复杂但更高的分辨率。

图13.单细胞谱系示踪的新方法^[5]

南模生物深耕基因修饰动物模型行业二十余年，致力于成为基因修饰模式生物行业的引领者，长期关注谱系示踪模型的新系统新技术，在谱系示踪模型的构建上拥有成熟的体系与丰富的经验，上述讲述的诸多模型均由南模生物构建。

在重组酶小鼠方面，南模生物拥有庞大的Find Cre^®数据库。该数据库包含超过400多种自主产权Cre/Dre重组酶工具鼠供您挑选。

在报告基因小鼠方面，南模生物也拥有丰富的荧光蛋白工具鼠（光标鼠^®️），即在目的基因的特定位置引入报告基因（包括荧光蛋白，如EGFP、mYFP等）或标记基因的小鼠模型，与特定重组酶工具鼠杂交，可以实现在特定细胞类群标记出所需荧光，帮助蛋白标记、谱系示踪等实验顺利进行。

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