实鼠罕见 | 杜氏肌营养不良
据统计，2023年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了5款全新的基因疗法，获批适应症均为罕见病。而在这五款药物中，包含有首个也是目前唯一一个获批的针对杜氏肌营养不良症的基因疗法。今天小编就带大家了解一下杜氏肌营养不良症。
杜氏肌营养不良
杜氏肌营养不良( Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）是一种X-连锁隐性遗传、致死性肌肉疾病。该病的发病机理为：患者X性染色体上的DMD基因突变，导致其编码的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）缺失或功能丧失，肌膜因结构稳定性下降而断裂，引起肌细胞坏死。DMD通常以 X 连锁隐性方式遗传，因此，绝大多数患者都是男性。
图1. 杜氏肌营养不良[1]
据统计，世界上每3500~6000个新生男婴中就有一名DMD患儿。其中，中国是“杜氏肌营养不良症”患病人数最高的国家之一，每年有400～500例患儿出生，累计患者高达7～8万人。
DMD基因结构与功能
DMD编码基因位于Xp21.1，基因全长约2220kb，含79个外显子，其cDNA长14 kb，是人类最大的编码基因。该基因突变率高，以外显子缺失最为常见，占55%~65%；点突变占25%左右；重复突变约占8%。
DMD基因编码dystrophin蛋白（抗肌萎缩蛋白），dystrophin主要分布于骨骼肌和心肌细胞，通过其N端和C端分别与细胞骨架和细胞膜，起支架作用，可以保护肌细胞膜在肌肉收缩时不受损伤。
图2. dystrophin蛋白[2]
DMD基因突变可引起多种肌肉系统疾病，根据突变的位点不同，患病的严重程度有所差别。杜氏肌营养不良的DMD突变类型为移码突变（读码框移动）或无义突变（生成一个终止密码子），这两种突变将导致dystrophin蛋白翻译的提前终止从而导致一个截短的dystrophin蛋白产生。除了杜氏肌营养不良， Becker muscular dystrophy（BMD）也是由DMD基因突变所引起，但BMD症状较轻。导致BMD的DMD突变类型为整码突变，该突变导致dystrophin蛋白部分缺失，但读码框未发生移动，dystrophin蛋白的N端和C端功能较为重要的一些序列得以保留。
图3. dystrophin蛋白[3]
临床特征
患儿通常于2~5岁时开始出现临床症状，患者开始出现由四肢近端开始的两侧对称进行性肌无力，导致坐、站困难，行走不便，上下楼梯困难。此后症状会逐步加重，同时累及心肌和呼吸肌，一般患者在7岁到12岁时，会彻底丧失自行行走能力。长期随访显示，DMD患者大多数活不过20岁，就会因心肺功能衰竭而死。
图4. 杜氏肌营养不良发展进程[4]
治疗手段
关于DMD的治疗，广泛采用的疗法是皮质激素，但该药物作用有限且副作用大。目前，关于DMD药物研发主要集中在基因疗法与干细胞疗法。这些疗法基于创新的治疗策略，其中包括基因递送、外显子跳跃、终止密码子通读和基因编辑。
图5. 治疗杜兴氏肌营养不良症的主要/辅助疗法[5]
基因递送疗法
基因递送疗法旨在在患者的肌肉细胞内重新表达健康的dystrophin蛋白。目前，除腺相关病毒AAV外，大多数病毒载体感染骨骼肌的效率并不高。但AAV的装载长度有限 (约 4.5 kb) ，无法装载DMD全长基因mRNA 转录本（14kb）。目前的代替方法是表达一个保留重要结构域的较短dystrophin（microdystrophin），完成大部分dystrophin蛋白的功能。
图6. microdystrophin示意图[5]
2023年6月获批的SRP-9001就属于基因递送疗法。临床前研究数据显示，SRP-9001的转基因被成功递送到肌肉细胞内，平均每个细胞核内载体基因拷贝数为3.87，并且这些转基因可以稳定地在目标组织（肌纤维）表达微抗肌萎缩蛋白。在临床试验中，患者在接受SRP-9001治疗1年后的运动能力显著优于对照组。
外显子跳跃疗法
外显子跳跃指的是利用反义RNA或单链DNA与突变的DMD基因转录出来的pre-mRNA结合，诱导跳过目标外显子，从而恢复阅读框架，产生具有部分功能的dystrophin蛋白。
图7. dystrophin蛋白[5]
基因编辑疗法
基因编辑是指采用基因编辑技术将突变的外显子完整地切掉，从而直接转录后续的外显子，因为突变的外显子已经被删除，后续的外显子能够以正确的读码框进行翻译。
图8. microdystrophin示意图[5]
与基因递送疗法一样，基因编辑会产生部分抗肌萎缩蛋白功能的重组蛋白。这些蛋白不能完全防止与 DMD 相关的肌肉损伤，一旦发生大规模肌肉损伤，基因编辑的细胞核就会消失。卫星细胞 (即肌肉干细胞) 不会吸收AAV，因此，修复后的肌肉将带有原来的 DMD变异。
终止密码子通读
终止密码子通读是使用一些化合物能够和转录蛋白复合物结合，使其在读至某个终止密码子的时候并不发生终止，而是使转录继续进行下去的疗法。在约 13% 的受影响患者中，DMD是由无义突变引起的。针对这些患者终止密码子通读可能是一个治疗新思路。
干细胞疗法
研究表明，干细胞移植在组织损伤修复等方面具有重要功能。使用干细胞治疗DMD需要从正常人体内分离出肌肉干细胞体外培养，然后注射到DMD患者的肌肉组织内。目前，干细胞疗法最大的局限性在于干细胞移植效率太低，仍有待发展。
据不完全统计，进入临床申请以上的DMD药物有12种，获批药物1种，大多数均为基因疗法，具体情况如下表所示：
杜氏肌营养不良相关小鼠模型
罕见病是全人类共同面临的公共健康问题。作为一家专注于模式生物领域的公司，南模生物长期助力罕见病基因治疗研究，构建了多种Dmd基因修饰小鼠，助力杜氏肌营养不良的相关机制研究需求，为相关药物的药效评估和安全性评价提供了强有力的工具。具体信息见下表：
Dmd-Q995X：
Dmd-Q995X点突变小鼠模型抓力显著降低，并且骨骼肌肌间隙变宽，肌纤维大小不一，细胞核聚集，炎性细胞浸润，表现出了DMD的症状。
图9. Dmd-Q995X小鼠(A)肌肉HE染色，(B)肢体抓力测试。
南模生物深耕基因编辑领域，提供全方位模式生物服务，包括基因修饰成品模型供应、个性化模型定制、饲养繁育、表型分析、药效评价等，满足不同实验室需求。
Reference
[1] Duchenne muscular dystrophy causes, symptoms, diagnosis, treatment & life expectancy (healthjade.net)
[2] Jones, D. Duchenne muscular dystrophy awaits gene therapy. Nat Biotechnol 37, 335–337 (2019). https://doi.org/10.1038/s41587-019-0103-5
[3] Aartsma-Rus A, Ginjaar IB, Bushby K. The importance of genetic diagnosis for Duchenne muscular dystrophy. J Med Genet. 2016;53(3):145-151. doi:10.1136/jmedgenet-2015-103387
[4] What is Duchenne muscular dystrophy? | Duchenne & You (duchenneandyou.eu)
[5] Verhaart IEC, Aartsma-Rus A. Therapeutic developments for Duchenne muscular dystrophy. Nat Rev Neurol. 2019;15(7):373-386. doi:10.1038/s41582-019-0203-3
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