小技巧，大不同｜高度均一的移植瘤接种方法揭秘
小鼠肿瘤模型
自小鼠肿瘤模型的诞生已有一百多年的历史，如今小鼠肿瘤模型在临床前抗肿瘤药物评价体系中发挥着重要的作用，为研究肿瘤发生与转移的机制、筛选和评价抗肿瘤药物的药效提供了有力的工具。
小鼠肿瘤模型大致可分为自发性肿瘤小鼠模型、诱发性肿瘤小鼠模型、基因修饰小鼠肿瘤模型、异种移植瘤模型（PDX或CDX）、同种移植型小鼠肿瘤模型（CDA或MDA)等。其中，移植模型更易于和更广泛用于临床前药效评价。
移植模型可分为细胞系移植和组织块移植。我们今天主要关注的是使用率最高的皮下细胞系移植瘤模型。做过皮下移植瘤接种实验的同学可能都遇到过，同时接种同等细胞量的小鼠长出的皮下瘤大小却差异明显，肿瘤不是过大就是过小，甚至形成串状肿瘤或不成瘤，导致很难挑出均一的小鼠入组，进行后续的药效试验。那么，如何获得均一性良好的皮下荷瘤小鼠模型？
考虑到皮下移植的过程，我们可以从以下几个方面入手：
细胞
成瘤实验前，选择合适的细胞株是非常重要的，即便是同一个癌种，不同细胞株的成瘤能力也可能天差地别。
例如乳腺癌细胞系JIMT-1增殖速度就远快于BT-474，因此建议大家先拿细胞株做个预实验，以便正式实验时合理安排实验进度。
Tips：对于生长速度较慢的肿瘤细胞可选用基质胶，促进肿瘤生长，通常加入30-50%的基质胶。
不同乳腺癌细胞成瘤曲线
其次，细胞接种量和细胞状态也是关键。接种细胞数量过少可能在老鼠皮下不能成瘤或成瘤后生长极慢，但接种量过多则可能引起肿瘤疯长，出现这些情况并不利于实验顺利开展。细胞接种量一般通过查阅文献确定或者做预实验确认，预实验通常在5E5-1E7细胞量之间设置梯度实验，接种体积为100-200 uL（细胞过量可能导致泄漏）。
裸鼠皮下注射HepG2细胞4周后肿瘤形成图
接种细胞要选择生长状态良好，无病毒、细菌或支原体等污染，处于对数生长期的细胞。细胞短途运输时可采用湿冰运输，如用冰袋，冰袋不可直接接触细胞，若短时间内运输室温即可。
动物
选择了合适的细胞株后，就要考虑用什么品系的小鼠来接种。对于来自小鼠的肿瘤细胞系，需要保持小鼠背景一致，如果肿瘤细胞系接种到背景品系不同的小鼠上，由于免疫系统的攻击，肿瘤细胞很难成瘤。如MC38是来自B6小鼠的结肠癌细胞系，所以适于其接种的小鼠背景的是B6。
而药效实验用的细胞株多为人源细胞株，人源细胞株更为接近人类肿瘤增殖情况，但却需要选择免疫缺陷小鼠，如M-NSG小鼠。Raji细胞系是人Burkitt's 淋巴瘤细胞系，皮下接种后，肿瘤生长较慢，20天后肿瘤体积达到1000mm3。
确定品系后，就要选择合适鼠龄的小鼠，通常为6-8周龄的小鼠，老年鼠皮下脂肪及结缔组织疏松，容易接出不规则的肿瘤。同一批小鼠周龄和体重差异要尽量小。小鼠进入动物房后适应性饲养一周左右，待其适应新环境后再进行接种实验。
图3 MC38在C57BL/6小鼠皮下的成瘤曲线以及Raji小鼠在M-NSG小鼠皮下的成瘤曲线
操作
实验员丰富的接种经验极为重要，新手往往因经验少而常出问题。如实验前准备不够充分，接种过程中手抖等。且新手实验员操作速度较慢而使接种时间延长，使细胞活性下降进而影响成瘤率。所以，新手要多多练习接种或请经验丰富的人员完成接种环节。
接种部位及接种深度也极为重要。选择血管丰富的区域接种，如腋窝部位或颈后方的肩胛骨上侧皮下等。进针时先用针头刺破皮肤，持平注射器使针头在皮下行进一段距离，稍微上挑后开始注射，注射过程中不可使针头移行。注射结束后压着针头快速拔出，同时用棉签轻压进针孔处以免有细胞液流出。
接种环节应由一人完成所有动物接种，避免同一实验多人。因每个人对卡尺的松紧和测量方向操作不同，为保持肿瘤体积测量的一致性，后续的量瘤环节也需要同一个人完成。
更多疑问？
1）如何避免串状肿瘤
抽取细胞后，可用酒精擦拭针头，避免针头上的肿瘤细胞沾到行针路径上。
2）接种针有气泡怎么办?
多取适当体积的液体，然后针尖朝上，往回吸一点，形成一个空间，再将空气推出，同时有部分液体推出，气泡即可以排除了。此时要注意肿瘤细胞比较粘，尽量排在纸上或者离心管里。
3）瘤子长不出来是怎么回事？
一方面可能是细胞状态差，活力不好，或是肿瘤细胞不易成瘤，需加入Matrigel辅助或增大接种量或更换细胞系；一方面可能是小鼠周龄太大，或小鼠免疫排斥，建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠（M-NSG小鼠＞NOD SCID小鼠＞裸小鼠）
4）小鼠瘤子长起来又消失？
肿瘤块先缩小，后变大很常见，很可能是炎症反应，导致肿瘤细胞被小鼠自身吸收，建议继续观察经过几周是否能长出来，若否，则需要更换小鼠。
5）是否可以在一只小鼠进行多个点荷瘤？
不可以，一只老鼠就只能接种一个点。因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下，可能会相互影响。
你也可能感兴趣
Cre-ERT2在无Tamoxifen诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT（雌激素类似物）与ERT结合，可使Cre-ERT2进核发挥Cre重组酶活性。
查看
