今天小编将给大家梳理一下以基因修饰小鼠为核心的疾病研究课题应该如何设计，需要遵循哪些基本原则，注意哪些问题。

疾病是多种多样的，但是研究疾病的方法是万变不离其宗。希望读完本文，对大家不论是阅读文献，设计规划课题，申请基金或者是发表高水平的研究论文，能有一些相应的启发或者是帮助。

想要运用基因修饰动物模型进行疾病的体内研究，需要有一个研究的目的基因(A)，一个要研究的疾病领域(B)，要有相应的模型(C)，并且这个基因在这个疾病模型中要有表型(D)。体内研究的本质其实是利用目的基因(A)的修饰在动物模型(C)上呈现出类似人类疾病(B)的表型改变(D)。其中基因是原因，疾病是一种宏观结果，表型是具象结果；而模型是重现整个过程的工具，也是整个研究的基石（Fig.1）。基因和模型的选择将直接关系到整个课题的质量与结果。

Fig.1 体内研究的组成要素

基因不是脱离背景随机选择的，它一定要照顾到跟其他几个要素的关系，首先要考虑它与研究疾病的关系，这里要体现出创新性与相关性。

这里的创新性不代表我们一定要选择全新发现的基因或者是研究背景非常稀少的基因，可以选择一个经典的基因，但他在我们研究的疾病领域没有过相关报道；或者经典的基因，相同的疾病领域，但是运用创新型的模型；再或者经典的基因，相同的疾病领域，但找到了新的突变。或者是我们研究一些真正创新性的基因，比如一些非编码的基因，microRNA，lncRNA或circRNA。

Fig2经典基因，同类疾病，不同基因修饰模型研究论文示例

这里是一个例子，研究同一个热门靶点基因Trem2在同一种疾病-阿兹海默症的作用，实际可以发表不同的研究论文（Fig.2）。第一篇文献运用了Trem2人源化基因修饰模型，第二篇则是使用Trem2的敲除模型。这提示我们研究经典基因在疾病中的功能时可以寻求不同的基因修饰模型，再加上找好研究角度及检测指标，实际上也可以体现创新性。

在讨论基因与疾病临床相关性时，其实讲的是基因在临床样本中是否有差异，包括表达的差异性，基因的突变或者修饰等等。而差异性又是否与疾病的严重程度，生存率等等挂钩。如果有，则必须在课题设计或者文章当中有所体现。那我们怎么去获取这些临床相关性的基因呢，一方面就是自己使用临床样本进行高通量筛查；或者是查阅一些临床实验文献；再或者找到我们所研究疾病的一些基因表达数据库进行查阅。

基因的功能往往通过基因与表型的关系体现出来，牵扯到基因修饰的方向以及所带来的表型后果。基因修饰的方向之一无非是过表达一个基因，然后观察这个基因所带来功能的获得，这其实体现的是充分条件关系，所讲述的逻辑是，一旦有这个基因，就能获得这个功能。之二无非是敲除或敲低一个基因，观察这个基因缺失带来的功能缺失，体现的是必要条件关系，所讲述的逻辑是，一旦没有这个基因，就无法实现某种功能。目前来看，基因敲除或条件性敲除是更容易出表型的一种修饰方式，也是目前来讲发表文章最多的。但是近些年来，过表达因为现成模型较少，有创新性，而且可以去过表达一些其他物种包括人源的基因，所以应用场景也慢慢多了起来。

Fig.3 基因(A)与表型(D)的关系要体现基因(A)的功能性

那我们怎么去找到关于目标基因跟表型关系的线索，有个较为全面的MGI数据库（http://www.informatics.jax.org/），这个数据库记录所有基因曾经有过的记录在册的相关基因修饰模型，以及曾经发表过的文章，如果我们现在手头就有个比较感兴趣的基因，可以从这个数据库中找到某些表型线索，如果恰好有比较契合自己研究疾病的表型出现，就可以运用到自己的研究当中去。由于篇幅所限，这个数据库如何使用，我们在后期单独推送相关文章，请感兴趣的读者持续关注。

除了基因以外，模型的选择也非常关键。根据模型与其他两个要素的关系，可以分为基因模型和疾病模型（Fig.4）。两者可以合二为一，但需要做到这个基因的功能足够关键，修饰它可以直接诱发疾病，还要做到这个基因具有一定的创新性，在该领域中没怎么报道过。大部分情况下，我们的所研究的基因只是疾病发生的一个必要非充分条件，因此需要分开构建。

Fig.4 疾病研究中模型的分类

比如，发表在Cell杂志上的“TREM2 Maintains Microglial Metabolic Fitness in Alzheimer’s Disease”这篇论文研究在分组时就很清晰地描述了几个模型：WT、5xFAD、Trem2^-/-、和Trem2^-/-&5xFAD，其中WT是野生型的“对照模型”；5xFAD转基因小鼠过度表达带有人类Swedish和Indiana突变的淀粉样蛋白前体相关基因，使其出现类似于人类阿兹海默症的症状，这就属于所谓“疾病模型”；而Trem2是本篇文章研究的靶标基因，Trem^-/-小鼠则属于所谓的“基因模型”；Trem-/-; 5xFAD小鼠则是“基因模型”与“疾病模型”叠加的产物，也是可以确定目的基因Trem在阿兹海默症中功能的最终模型。

Fig.5 基因模型和疾病模型在具体文献(Cell，2015)中的示例

我们在选择疾病模型的时候要注意类似性，重复性，可靠性等原则。简单来讲，类似性就是选用的模型要跟人体发病过程类似；重复性就是多次实验结果一致，同批实验，动物表型均一。而可靠性主要是需要排除该疾病模型中，一些其他疾病的干扰，证明目标表型的出现是可靠的。

我们就以肿瘤模型为例（Table 1），移植瘤模型中，人源肿瘤相比于鼠源肿瘤更接近人体肿瘤的真实情况，因此在类似性上更有优势。原发肿瘤模型中的诱导型模型一般是使用较强剂量的致癌物质，不太符合患者正常患癌的真实情况，类似性不好。因为过度刺激，还会诱发一些其他疾病，可靠性也较差。基因修饰肿瘤小鼠，可以保留一些肿瘤微环境，类型性可靠性可以得到保证，但同一批次发生肿瘤的时间会有差异，就需要扩大筛选。由于模型的不完美性，多疾病模型论证就比较流行，在肿瘤研究中以基因修饰小鼠肿瘤模型为主，人源移植瘤为辅的方式较为多见。

Table 1 各类肿瘤模型的特性

对于基因模型的选择，主要注意的是我们选择什么样的基因修饰类型，一般分为转基因，敲除，点突变和基因敲入。在这里需要强调的一点是在基因修饰类型上有条件的话，也尽量采用多模型论证法，可以加大实验说服力。

Fig.6 基因模型的多模型论证示例（Circulation, 2018）

这里是多模型论证的一个示例（Fig.6），发表在Circulation上的“Vascular Smooth Muscle-Specific Progerin Expression Accelerates Atherosclerosis and Death in a Mouse Model of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome”这篇论文中研究人员比较巧妙地构建了一个品系，同时实现核纤层蛋白Lamin A的敲除和点突变（临床上已发现其突变体与临床相关）。研究人员通过打靶就把一组loxP-stop-loxP序列和突变的位点引入小鼠相应的基因组位置，由于stop序列的存在，A蛋白无法翻译出来，是敲除的模型。而一旦与Cre工具鼠交配，stop序列将被删掉，A蛋白将会以突变形式（Progerin）被翻译出来，这样就可以一举两得。

谈及这个例子的目的并不是鼓励大家一定要一次性构建出这类“两用”模型（是否可行取决于基因结构及其他特性），而主要是说明往往我们在进行科学论证的时候，对同一问题，需要从不同的角度或不同模型去论证，这种思想需要贯穿着整个科研历程。

我们所有的研究成果，都需要使用表型数据给呈现出来。表型也可分为疾病模型表型和基因模型表型。表型呈现的基本逻辑有两种，一种是回复验证，具体是构建了疾病模型，表型出现了，若叠加基因模型将会回复该表型，使病情得到缓解。另一种，递进验证，具体是构建疾病模型，表型出现了，若叠加基因模型将会加剧该表型。

表型回复验证的示例（Fig.7），来自Oncogene的“MembraneMucin Muc4 promotes blood cell association with tumor cells and mediatesefficient metastasis in a mouse model of breast cancer”这篇文章中介绍乳腺癌模型的肺转移表型检测，NDL代表的是乳腺癌的疾病模型，在小鼠肺部出现了多处病灶，而叠加了基因敲除模型Muc4KO，发现纯合子Muc4KO/NDL中，病灶大大减少。这就是典型的回复验证。

Fig.7 敲除目的基因Muc4后乳腺癌肺转移情况减轻示例（Oncogene，2018）

表型递进验证的示例（Fig.8），还是上文提到的Circulation杂志关于“动脉粥样硬化”的文章， ApoE基因敲除小鼠喂高脂高胆固醇饲料，可以诱发动脉粥样硬化，这类疾病小鼠模型将其主动脉通过油红染色，看到实际上在血管壁上是有脂肪堆积的。而叠加了基因模型之后，脂肪堆积的程度明显更高了，而且小鼠的生存率大大降低。这就是采用了递进验证的方法去验证基因功能。

Fig.8 Lmna点突变小鼠动脉粥样硬化表型加重示例（Circulation，2018）

回复验证和递进验证该如何选择，这往往要考量疾病模型和基因特性两个方面，如果疾病模型的疾病表现非常严重，这时候往往采用回复验证的方法，因为很难在一个高表现的表型上去体现疾病加重。反之，就采用递进验证。对于基因来说，如果这个基因是疾病发生的必要条件因子，那就采用回复验证的方式，反之如果是充分条件因子，则可以采用递进验证。

对表型的检测途径（Fig.9）是需要通过不同的检测方法和不同的分子标记来实现，需要时刻遵守多角度论证的思维，即一种疾病尽量采用多个表型去验证，而一种表型多个检测方法验证，同一种检测方法也需要尽量采用多个标志物（Marker）来验证。

Fig.9 表型检测途径

上文提到Oncogene关于乳腺癌的研究文章，里面分别检测了原发瘤和转移瘤（Fig.10）两个表型，发现敲除目的基因Muc4对于原发瘤的影响很小，原发灶依然是高分化异质性的乳腺癌；然而转移灶明显减少。这就表明，尽量多检测几个表型，可以避免忽略所研究目的基因应有的功能。

Fig.10 原发瘤和转移灶的表型研究示例（Oncogene，2018）

一种表型采用多个检测手段的示例（Fig.11)，使用Westernblot以及免疫荧光两种方法去检测同一种蛋白的表达情况，可以避免由于某种技术手段本身的限制带来的对表型的误判。

Fig.11 对同一表型采用不同检测方法的示例（Leukemia，2020）

一种检测方法采用多个标志物检测的示例（Fig.12），同时采用F4/80和CD41标识巨噬细胞和血小板，表明Muc4敲除后，巨噬细胞和血小板等免疫细胞的数目变化跟肿瘤组织大小具有相关性。通过标志物的多样性，去检测同一个表型的多个维度，可以增加实验的可信度。

Fig.12同一检测方法利用不同标志物进行检测的示例（Oncogene，2018）

文中示例文献：