2018年7月2日，复旦大学附属妇产科医院李明清研究员课题组在《Autophagy》上发表了最新的研究成果“Suppression of autophagy and HCK signaling promotes PTGS2^high FCGR3^- NK cell differentiation triggered by ectopic endometrial stromal cells”，揭示了子宫内膜异位微环境中，雌激素-自噬-STAT3-HCK轴参与了PTGS2^high FCGR3^-NK细胞的分化，为治疗NK细胞杀伤活性受损相关疾病提供了科学依据。

南模生物为该研究构建了HCK基因敲除小鼠模型。

子宫内膜异位症（EMS）是指有活性的内膜细胞种植在子宫内膜以外的位置，它是一种雌激素依赖的妇科疾病。越来越多的研究发现NCAM1^dim FCGR3⁺ NK细胞和NCAM1^bright FCGR3^-（一类低杀伤活性、主要分泌细胞因子的）NK细胞比例的失衡和NK细胞杀伤活性不足与多种生理和病理过程相关，包括正常妊娠、传染病、恶性肿瘤等等，其中也包括子宫内膜异位症。NK细胞杀伤活性不足会导致子宫内膜异位症中局部免疫环境的功能失调，影响异位子宫内膜组织的清除。不过在异位病变微环境（ELM）中NK细胞杀伤活性受损的原因仍不清楚。

在该课题组早前的研究中，发现异位内膜细胞（ESCs）的自噬水平下降，雌激素引起的EMS自噬抑制是依靠CXCL12/CXCR4的相互作用，部分通过 NF-κB信号通路。不过，ESCs的自噬水平与NK细胞的功能与杀伤活性降低的关系仍有待研究。因此，这项研究就旨在阐述ESCs自噬是否会调节FCGR3⁺ NK细胞与FCGR3^- NK细胞之间的平衡，以及这些异常自噬的ESCs和NK细胞在EMS发展中的影响。

研究结果

（1）随着病程发展，异位病变微环境（ELM）中FCGR3^- NK与FCGR3⁺ NK细胞的比例增加。

Fig1. The low cytotoxic FCGR3^- NK cells increase in ELM with disease progression.

（2）异位内膜细胞（ESCs）自噬水平下降，通过STAT3失活引发HCK下调，且HCK下游分子CXCL8/IL8-IL23A的分泌增加，从而导致FCGR3^- NK细胞的增加以及NK细胞杀伤活性的降低。

与正常子宫内膜细胞相比，异位内膜细胞的自噬相关基因（MAP1LC3B，也叫LC3B和BECN1，也叫Beclin1）表达水平显著下降。通过将FCGR3^- NK细胞分别与抑制自噬（3-MA-ESC和siATG5-ESC）、促进自噬（Rap-ESC）和未处理（Ctrl-ESC）的异位内膜细胞共培养，来模拟体内微环境，结果发现与未处理的ESCs共培养后FCGR3- NK细胞比例上升、而且KIR2DL1和KIR3DL1表达上调、NCR3, NCR2, IFNG, PRF1和GZMB表达下调；而与抑制了自噬的ESCs共培养的NK细胞这种变化更加强烈，与促进自噬的ESCs共培养则会减弱这些变化（Fig2）。

自噬水平的下降触发了PKH26⁺ FCGR3⁺ NK细胞亚群向PKH26⁺ FCGR3^- NK细胞的分化，同时小鼠EMS模型在注射自噬抑制剂3-MA后也表现出子宫内膜异位和腹膜液中FCGR3^- NK细胞的增加（Fig3）。 

Fig2 The low autophagy of ESCs leads to the high level of FCGR3^- NK cells in vitro.

Fig3 The low autophagy of ESCs triggers more differentiation of FCGR3^- NK cells from FCGR3⁺ NK cells.

通过分析FCGR3^- NK细胞的基因表达芯片，发现HCK（造血细胞激酶）在异位ESCs中的表达呈现显著下降，同时随自噬水平的变化而变化。ATG5失活导致自噬水平、HCK表达以及STAT3磷酸化水平下降；而STAT3抑制剂可以部分抑制由于自噬水平上调引起的HCK表达上调。说明自噬通过STAT3来调节HCK水平（Fig4）。

将HCK基因敲除小鼠子宫内膜碎片注射到野生型小鼠体内来制备HCK缺失的EMS模型，体内实验结果也证明HCK缺失会加快病程的发展、增加FCGR3^- NK细胞，但PRF1⁺、GZMB⁺、IFNG⁺ NK细胞减少（Fig5）。

Fig4 ESC autophagy upregulates expression of HCK by activating STAT3 signaling pathway.

Fig5 Hck downregulates FCGR3^- NK cells.

在对HCK下游靶基因的分析中，发现CXCL8和IL23A水平受HCK和自噬水平的影响，HCK-/-EMS模型或自噬抑制剂3-MA处理后，IL23A表达上调（Fig6）。体外对CXCL8和IL23A过表达和RNAi，发现HCK-CXCL8-IL23A轴确实参与调节FCGR3^- NK细胞的分化（Fig7）。

Fig6  The low level of autophagy and HCK signaling stimulates the secretion of CXCL8 and IL23A by ESCs.

Fig7  The HCK-CXCL8-IL23A signal axis of ESCs regulates FCGR3^- NK cells differentiation.

（3）FCGR3^- NK细胞的分化受MIR1185-1-3p负调控，其下游靶基因PTGS2会增加FCGR3- NK细胞，促进子宫内膜异位的发展。

通过比较ESCs自噬受到抑制以后NK细胞中microRNA的表达水平，发现9个microRNA表达变化显著。而其中，只有MIR1185-1-3p在与抑制自噬的ESCs共培养的NK细胞中表达下降；在促进自噬的ESCs共培养的NK细胞中表达上升。同时，CXCL8和IL23A下调MIR1185-1-3p水平。患者腹膜液中NK细胞的MIR1185-1-3p也呈低水平表达。体外MIR1185-1-3p过表达的NK细胞中FCGR3、PRF1、GZMB和IFNG表达下降。说明自噬和HCK水平调节MIR1185-1-3p，从而负调控FCGR3-PRF1^low GZMB^low IFNG^low NK细胞分化（Fig8）。

Fig8 The FCGR3^- NK cell differentiation in ELM is negatively regulated by MIR1185-1-3p.

通过对比芯片差异数据与MIR1185-1-3p下游潜在靶基因，只找到一个重合基因——PTGS2。MIR1185-1-3p过表达会抑制PTGS2表达。EMS小鼠模型中，HCK缺失导致PTGS2⁺ NK细胞的增加（Fig9）。而与PTGS2^- NK细胞相比，PTGS2⁺ NK细胞的FCGR3、PRF1 和 IFNG的表达很低。在PTGS2基因敲除小鼠中FCGR3⁺ PRF1⁺ GZMB⁺ IFNG⁺ NK细胞比例更高（Fig10）。

Fig9 The autophagy and HCK signaling of ESCs are involved in regulating the PTGS2 level in NK cells by MIR1185-1-3p.

Fig10 There are more FCGR3⁺ PRF1⁺ GZMB⁺ IFNG⁺ NK cells in PF and the uterus of ptgs2^-/- mice.

FCGR3表达缺失会导致NK细胞中PTGS2表达上调，且PRF1⁺GZMB⁺ IFNG⁺ NK细胞比例减少。抑制FCGR3和抑制PTGS2在影响PTGS2、PRF1、GZMB表达中的作用刚好是相反的。而且，在子宫内膜异位症中PTGS2⁺FCGR3^- NK细胞与PTGS2^-FCGR3⁺ NK细胞的比例显著上升，PTGS2⁺FCGR3^- NK细胞的GZMB、PRF1 和 IFNG低表达（Fig11）。说明PTGS2和FCGR3之间存在负反馈关系，对于调节NK细胞分化和功能具有重要影响。

体内外实验都证明抑制FCGR3在小鼠子宫基质细胞（USCs）的活性、凋亡以及影响子宫内膜异位病程发展等方面都与抑制PTGS2有着截然相反的效果。将PTGS2基因敲除小鼠的NK细胞注射到EMS小鼠模型中后，子宫内膜异位的程度显著缓解（Fig12）。说明自噬和HCK途径被抑制后，PTGS2^highFCGR3^- NK细胞会促进子宫内膜异位的发展。

Fig11 PTGS2⁺ FCGR3^- NK cells present low levels of PRF1, GZMB and IFNG.

Fig12 PTGS2^highFCGR3^- NK cells accelerate the growth of ectopic lesion and progression of EMS.