2023年3月24日，上海市免疫学研究所叶菱秀团队在Science Immunology期刊在线发表了题为“DNA Repair Mechanisms That Promote Insertion-Deletion Events During Immunoglobulin Gene Diversification”的研究论文。该论文鉴定了在抗体多样化过程中低频率DNA片段插入事件和±1bp缺失或插入事件，揭示了±1bp和>1bp缺失或插入产生机制的差异。在此基础上，通过外切酶或聚合酶的遗传学操作获得了能够增加抗体基因缺失或插入的小鼠模型，为广谱中和抗体的筛选提供了新的思路和方法。

南模生物为该研究构建了多种基因修饰小鼠：Fen1-KO, Ung-KO, Polh-KO, Msh2-KO, Exo1-KO, Pms2-KO, Mlh1-KO, Apex2-KO, R26-LSL-Trex2-IRES-GFP。

DNA片段缺失或插入是基因组中单个或多个核苷酸的缺失或插入。在免疫球蛋白即抗体的基因可变区外显子中，片段缺失或插入(<50 bp)通常会导致B细胞受体编码错误。然而，“塞翁失马，焉知祸福”，长片段缺失或插入又是罕见抗病毒广谱中和抗体(broadly neutralizing antibody, bnAbs)获得广谱中和能力的关键。例如，发生在抗HIV广谱中和抗体基因上的片段插入大大提高了抗体与HIV包膜三聚体表位的结合力。但是，由于片段缺失或插入在抗体多样化过程中发生频率较低，很难用传统模型和方法检测得到。因此，片段缺失或插入在抗体多样化中的分子机制仍知之甚少。

本研究利用一种抗体无功能等位基因系统，同时结合超深度测序克服了片段缺失或插入检测的困难，成功捕捉到生理条件下真实的片段缺失或插入事件（图1）。通过对片段缺失或插入图谱的分析发现±1bp缺失或插入发生最频繁，占总缺失或插入事件的45%左右（图2）。对>1bp碱基插入的序列特征进行分析发现大部分的碱基插入为邻近序列的复制插入。发生在CDR3上的复制插入能够增加CDR3的长度，可能促进广谱中和抗体的产生。

在体细胞高频突变（Somatic Hypermutation, SHM）过程中，胞苷脱氨酶AID能够作用于抗体可变区基因，引起DNA损伤。该损伤可以通过碱基切除修复途径（base excision repair, BER）或错配修复途径（mismatch repair, MMR）进行修复，产生碱基突变以及DNA片段的缺失或插入。为了探究DNA片段缺失或插入产生的分子机制，本研究在抗体无功能等位基因小鼠模型基础上构建了15种具有代表性的DNA损伤应答修复因子缺陷小鼠模型（图1），并对其片段缺失或插入图谱进行了系统的描绘（图3）。研究发现±1bp与>1bp缺失或插入产生的分子机制截然不同（图3-4），1bp缺失通过BER途径产生，1bp插入既可以通过BER途径产生，也可以通过MMR途径产生，产生过程需要核酸外切酶ExoI和易错DNA聚合酶Polη的参与。>1bp缺失或插入都是通过BER途径产生的，并且都需要DNA双链断裂损伤修复因子53BP1的参与。此外，>1bp插入还需要非同源末端连接途径和DNA聚合酶Polλ的参与。对片段缺失或插入分子机制的全面解析有助于理解广谱中和抗体产生的机制，为广谱中和抗体的生产提供了新的思路，为HIV等疫苗的设计提供了新的理论基础。

在机制研究基础上，本研究成功构建了能够增加抗体基因缺失或插入频率的小鼠模型（图3），核酸外切酶Trex2过表达的小鼠模型能够促进片段缺失的产生，DNA聚合酶Polβ条件性敲除的小鼠模型能够促进片段插入的产生。这两种小鼠模型可以与人源化抗体小鼠模型联合使用，用于疫苗的研发和广谱中和抗体的生产。

图4：抗体基因SHM中DNA片段缺失或插入机制的系统解析

上海交通大学医学院上海市免疫学研究所叶菱秀研究员，瑞典卡罗琳斯卡医学院Qiang Pan-Hammarström教授和意大利都灵大学病理学系Roberto Chiarle教授为本论文的共同通讯作者，郝茜助理研究员和占传棕博士研究生为本论文的共同第一作者。