Circulation│c-kit 细胞对成体心肌细胞贡献的再评价
7月8日，国际学术期刊Circulation在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组与中国医学科学院阜外医院心血管疾病国家重点实验室聂宇课题组的最新科研成果“Reassessment of c-Kit+ Cells for Cardiomyocyte Contribution in Adult Heart”。
该研究利用双同源重组系统(Cre-loxP和Dre-rox)构建了两个可以有效标记Kit+细胞且不影响内源Kit基因表达的小鼠模型，并利用这些模型对Kit+的心脏干细胞(CSCs)是否参与成体心肌细胞的生成进行了探讨。研究结果显示，无论心脏处于稳态或损伤状态下，都不会参与新生的心肌细胞的生成。
南模生物为该研究构建了Kit-2A-Cre和Kit-IRES-Cre;Tnnt2-DreER这两个小鼠模型。
限于之前的小鼠模型无法有效追踪CSCs的命运，Kit+ CSCs是否具有肌源潜能一直存在争议[1-3]。去年发表在Nature上的一篇文章对已有的Kit-Cre模型进行了总结，并概括了现有模型的两大缺陷：1)构建时同源重组酶Cre取代了内源Kit基因的表达，从而引发单倍体不足(haploinsufficiency)，即单个Kit等位基因不足以维持其正常功能；2)无法标记Kit表达量低的细胞。
为了解决Kit+ CSCs是否具有肌源潜能这一问题，本研究另辟蹊径，构建了2个全新的Kit-Cre工具鼠品系(Fig.1)。为了避免对c-Kit基因产生影响，研究人员选择将Cre插入到Kit的最后一个外显子后，并通过2A或者IRES元件分隔，从而实现与内源Kit共同表达的目的。
Fig.1 Schematic figure showing knock-in strategies for Kit-2A-Cre or Kit-IRES-Crealleles by homologous recombination.
Kit2A-Cre/2A-Cre 和 KitIRES-Cre/IRES-Cre纯合子小鼠可以正常存活至成年，检测野生型、纯合子、杂合子小鼠在大小、体重以及心脏大小、体重占比、功能等生理指标均没有差别，并且Kit在纯合小鼠中表达完整(Fig.2)。
Fig.2 Immunostaining for c-Kit on heart sections show its expression in tissues ofall groups (12–16W).
为了确定同时标记Kit+细胞和心肌细胞，研究人员首先选择用心肌细胞特异表达的Tnnt2基因标来记心肌细胞，为此构建了Tnnt2–DreER小鼠模型。随后通过Kit–2A-Cre;R26–GFP，Tnnt2–DreER;R26–rox–tdTomato交配，利用Cre-loxP和Dre-rox双同源重组系统，将Kit+细胞标记为绿色，将心肌细胞标记为红色，这样就可以从Kit+细胞中区别出非心肌细胞(GFP+tdTomat-)和心肌细胞(GFP+tdTomato+)(Fig.3)。
Fig.3 Strategy for labeling of Kit+ cells by dual recombinases-based system.
那么GFP+tdTomat-的非心肌细胞是否会产生维持GFP+tdTomat-的新生心肌细胞呢？
在小鼠心肌梗死(MI)两周前进行他莫昔芬诱导，MI四周后进行组织采样检测(Fig.4)，观察发现GFP+tdTomato+心肌细胞分布于梗死及梗死边缘位置，但是在所有的组织切片中都没有观察到GFP+tdTomato-心肌细胞，说明心肌梗死后Kit+非心肌细胞不参与新生心肌细胞的生成。
Fig.4 Immunostaining for green fluorescent protein (GFP), tdTomato, and Troponin I(TNNI3) on myocardial infarction (MI) heart sections.
利用Kit–IRES–Cre模型替换Kit-2A-Cre模型重复该研究(Fig.5)，得到的也是相同的结果。
Fig.5 Immunostaining for GFP, tdTomato, and TNNI3 on MI heart sections.
本研究将两个新的Kit-Cre模型与双同源重组酶介导的谱系追踪策略结合，追踪kit在成体心脏中的命运，回避了Kit-Cre谱系追踪问题；不同于以前的Kit-Cre模型，新的Kit-Cre模型不存在Kit单倍体不足的问题，同时标记所有Kit+细胞及其后代。
本研究解决了已有Kit-Cre模型的两大缺陷，间接证明了内源的Kit+CSCs不是成体心脏心肌更新和修复所必需的。
南模生物提供全方位模式生物服务，包括模型定制服务、成品模型、饲养繁育、表型分析、药物筛选，可提供小鼠、大鼠、斑马鱼及线虫模型，满足不同实验室需求。
References
1.Ellison GM, Vicinanza C, Smith AJ, Aquila I, et al.Adult c-kit+ cardiac stem cells arenecessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell.2013;154:827–842. doi: 10.1016/j.cell.2013.07.039
2.van Berlo JH, Kanisicak O, Maillet M, et al.c-kit+ cells minimally contribute cardiomyocytes to theheart. Nature. 2014;509:337–341. doi: 10.1038/nature13309
3.Vicinanza C, Aquila I, Cianflone E, Scalise M, Marino F, et al. KitCre knock-in mice fail to fate-map cardiac stem cells.Nature. 2018;555:E1–E5.doi: 10.1038/nature25771
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