(A)Nucleotide sequence alignment of the target sites nox, pox and loxP. The 13 base pair (bp) inverted repeats are indicated by arrows with the spacer sequences shown in bold. Identical nucleotides are marked with an asterisk. Full symmetry was introduced into the pox site (A to T; marked in red) 

(B) Schematic presentation of the Nigri and Panto coding sequences and the relative position of their native target sites. 

(C) Comparison of the homology of the recombinases and their target sites among each other (in percent). The number of amino acids (aa) for each recombinase is indicated. （Sci Rep. 2016 Jul 22;6:30130.）

基于Nigri-nox的双报告基因谱系示踪系统

Fig1. 基于Nigri-nox的双报告基因谱系示踪系统的建立

（A）R26-NLR双报告基因小鼠的敲入策略示意图。 （B，C）R26-NLR与A-Nigri和B-Cre小鼠品系杂交重组示意图。 （D）Cdh5-Nigri基因敲入小鼠策略示意图。 （E，F）E14.5天Cdh5-Nigri; R26-NLR胚胎（E）和P7天Cdh5-Nigri; R26-NLR小鼠心脏（F）的整体荧光检测。箭头表示ZsGreen+细胞。 （G）E14.5天Cdh5-Nigri; R26-NLR胚胎的ZsGreen，tdTomato和VE-cad免疫染色，显示VE-cad+内皮细胞被ZsGreen+标记（箭头）。 （H）对P7天Cdh5-Nigri; R26-NLR小鼠心脏切片进行ZsGreen，tdTomato和PECAM免疫染色，显示ZsGreen+（箭头）可有效标记内皮细胞。

Cdh5-Nigri;R26-NLR小鼠心脏中ZsGreen绿色荧光标记的细胞对心脏瓣膜中的大多数PDGFRα+间充质细胞/成纤维细胞起作用（图2A）。没有观察到内皮细胞对心肌细胞的任何贡献（图2B）。 有趣的是，一部分Cdh5衍生细胞也表达aSMA或PDGFRb，表明内皮细胞可能在发育中心的心肌中分化成平滑肌细胞或周细胞（图2C-D），证明内皮细胞是冠状动脉平滑肌细胞和周细胞的祖细胞。

ig2.由Cdh5-Nigri标记的心脏细胞谱系。（A）心脏切片的ZsGreen和PDGFRa免疫染色显示Cdh5-Nigri标记的内皮细胞产生瓣膜成纤维细胞。 （B）心脏切片ZsGreen和TNNI3免疫染色显示Cdh5-Nigri标记的细胞对心肌细胞没有贡献。 （C）心脏切片上ZsGreen和aSMA的免疫染色显示Cdh5-Nigri标记的细胞也贡献平滑肌细胞。 黄色箭头表示ZsGreen+aSMA+平滑肌细胞。 （D）心脏切片ZsGreen和PDGFRb免疫染色显示Cdh5-Nigri标记的细胞在心脏发育期间产生一部分周细胞。

Cre重组酶仅对loxP位点进行重组，不会交叉作用于nox位点。将广泛表达的ACTB-Cre和UBC-CreER分别与R26-NLR小鼠交配，获得双阳性小鼠，结果显示仅能检测到tdTomato红色荧光信号，没有ZsGreen绿色荧光信号。

Fig3. Cre不重组nox位点。（A）ACTB-Cre；R26-NLR重组示意图。 （B）E14.5天ACTB-Cre; R26-NLR胚胎的整体荧光视图。（C）在E14.5天 Cre +和Cre-胚胎上对ZsGreen和tdTomato进行免疫染色。 （D）C图中心脏的放大视图显示Cre +胚胎中的所有细胞都是tdTomato + ZsGreen-，而Cre-胚胎中没有荧光细胞。 （E，F）示意图显示在E12.5处理他莫昔芬（Tam）后，诱导UBC-CreER与双报道系R26-NLR的CreER-loxP重组。 （G）E14.5天UBC-CreER; R26-NLR胚胎整体荧光视图。 （G，H）在E14.5天UBC-CreER; R26-NLR胚胎的ZsGreen和tdTomato免疫染色结果显示在Tam诱导后所有细胞都是tdTomato + ZsGreen-。

为了进一步展示R26-NLR新系统的优势，研究人员利用这一系统探究了在小鼠心脏发育过程中瓣膜间充质细胞的起源及动态变化。哺乳动物心脏包括四组瓣膜，包括两组房室瓣膜（二尖瓣和三尖瓣），两组半月瓣（主动脉瓣和肺动脉瓣）。前人的研究证明房室瓣膜间充质细胞主要来源于心脏心内膜和心脏心外膜，而半月瓣间充质细胞主要来源于心脏心内膜和神经嵴细胞。

为了更方便地在同一个体观察相应的两群干细胞群对瓣膜发育贡献的动态变化。首先，将R26-NLR系统与Tbx18-Cre小鼠（标记心脏心外膜）和Cdh5-Nigri小鼠（标记心脏心内膜）交配得到能够同时标记心脏心外膜和心脏心内膜的Tbx18-Cre;Cdh5-Nigri;R26-NLR三阳性小鼠，通过对小鼠发育各个时间点的取样分析，发现这两群干细胞对房室瓣膜的贡献是动态变化的，E14.5之前，二尖瓣和三尖瓣的腔壁侧瓣膜（与心室壁相接触）间充质细胞主要来源于心内膜，E14.5天之后，随着瓣膜发育，自瓣膜近端到远端逐渐被心外膜分化来源（EPDCs）的间充质细胞所替代，这种细胞更替现象能够一直持续到出生后P7天左右，而二尖瓣和三尖瓣的室间隔瓣膜（与室间隔相接触）间充质细胞从瓣膜开始形成到出生后基本都来源于心脏心内膜。

Fig4. 同时追踪两个不同的祖细胞群体的对房室瓣膜间充质贡献的动态变化。

（A）R26-NLR与Tbx18-Cre和Cdh5-Nigri交配后的重组示意图。 （B）取样分析时间点示意图。 （C）心脏切片的ZsGreen，tdTomato和PECAM免疫染色。 （D）模式示意图显示Tbx18-Cre和Cdh5-Nigri对三尖瓣发育的贡献。 （E）心脏切片的ZsGreen，tdTomato和PECAM免疫染色。 （F）模式示意图显示Tbx18-Cre和Cdh5-Nigri对二尖瓣发育的贡献。 （G）在房室瓣膜发育期间由Tbx18-Cre和Cdh5-Nigri标记的间充质细胞的百分比定量。

此外，利用Wnt1-Cre;Cdh5-Nigri;R26-NLR三基因型小鼠，在体内同时标记示踪神经嵴细胞（Wnt1-Cre）和心内膜细胞，通过对小鼠发育各个时间点取样分析，发现半月瓣发育中间充质细胞来源的动态变化与房室瓣不同，在发育早期（E13.5左右），主动脉瓣膜间充质主要起源于神经嵴细胞，随着瓣膜发育直到小鼠出生后，神经嵴细胞来源的比例降低，心内膜来源的比例升高，但是并不会被全部替换掉，最终保持3:2左右比例，而肺动脉瓣发育中没有观察到类似的动态变化，基本一直保持3:1左右比例。

Fig5.同时追踪两个不同的祖细胞群体的对流出道瓣膜间充质贡献的动态变化。

（A）R26-NLR与Wnt1-Cre和Cdh5-Nigri交配后的重组示意图。  （B）取样分析时间点示意图。 （C）在含有肺动脉瓣膜的心脏切片的ZsGreen，tdTomato和PECAM免疫染色。 （D）在含有主动脉瓣的心脏切片的ZsGreen，tdTomato和PECAM免疫染色。 （E）在半月瓣形成期间由Wnt1-Cre和Cdh5-Nigri标记的细胞的百分比定量。

传统的谱系示踪标记系统中，对于由两个不同的基因启动子驱动的两个不同的祖细胞群，第一次重组后的报告基因不能维持，并在第二次重组后被第二个报告基因取代。这样只允许标记一组祖细胞及其亚群，不能标记由两个完全不同独立的细胞群。新的交错双重组酶报告基因R26-NLR系统，允许我们在发育过程中同时靶向两个不同的祖细胞群体，并用不同的告基因追踪它们的细胞命运，在体内研究的成功应用展现了其在解决多细胞起源科学问题中的应用前景，而且也为更加准确的谱系示踪技术提供了可靠的技术思路。

Fig6. 传统谱系示踪与新型谱系示踪系统的比较（A）常规谱系示踪策略使用两种不同的启动子，其驱动两种不同小鼠中的Cre重组酶用于其命运作图研究。 （B）在新策略中，Cre和Nigri重组酶可以在一只小鼠内同时由两种不同细胞特异性启动子驱动，并允许在一只小鼠中的两个细胞群体同时进行命运示踪。