这项工作开创性地将精子发生同步化方法与生殖细胞特异性荧光标记相结合，分离获取了高纯度的处于不同发育阶段的小鼠生精细胞，并应用高精度单细胞转录组测序的方法，建立了小鼠精子发生过程的转录组精细图谱。

同时该工作系统揭示了精子发生过程中基因表达调控的动态变化，筛选、验证了不同发育阶段的关键调控因子，证实了不同发育阶段精子细胞与卵细胞结合后产生的胚胎具有不同的发育潜能，并系统地总结了精子发生过程中RNA可变剪接的动态变化、减数分裂性染色体失活（MSCI）等多种关键生物学事件的核心规律。

研究背景

哺乳动物精子发生是一个高度复杂且受到严密调控的细胞发育过程。该过程包含三个最基本的生物学事件：有丝分裂、减数分裂和精子形成。在有丝分裂过程中，精原细胞经历自我更新、增殖和分化，保证了精子发生的持续性和稳定性；在减数分裂过程中，发生同源染色体的精准配对、重组交换与精确分离，在保证遗传稳定性的基础上产生了配子遗传物质的高度多样性；在精子形成过程中，则发生了顶体形成、组蛋白-鱼精蛋白转换、核浓缩和包装重建等一系列复杂的细胞生物学和形态学变化，使精子细胞具备了运动和受精潜能。上述过程中生精细胞类型的多样性和生物学事件的高度复杂性决定了精子发生是研究基因表达调控的绝佳模型。

然而，经过数十年的深入研究，目前对哺乳动物精子发生的研究仍然存在着许多制约因素。例如，目前尚未有高效和便捷的生精细胞体外培养体系，而且由于数十类生精细胞和多种体细胞同时存在于睾丸组织当中，要获取高纯度的、处于特定发育阶段的各级生精细胞是极其困难的。因此，当前对精子发生机制的研究多采用的是对类型混杂的群体细胞的系综平均研究，而非对单个性细胞直接进行系统研究。这也就导致长久以来我们对哺乳动物精子发生的调控机制缺乏一个系统全面的理解。

研究进展

精子发生同步化方法获得高纯度各级生精细胞的策略

精子发生是一个连续且非同步化的过程，表现为生精上皮的细胞组合存在周期性变化，沿生精小管纵轴方向的不同位置处于不同的生精上皮周期。睾丸内生精细胞类型的复杂性则源于生精上皮周期性释放的维甲酸信号——维甲酸为精原细胞分化的必需因子，精原细胞分化的不同步造成了不同生精上皮内生殖细胞组合的多样性。

基于精原细胞分化的机理，该研究通过对新生小鼠连续7天饲喂维甲酸合成通路的抑制剂WIN 18,446，使精子发生阻滞于未分化型精原细胞阶段，在第8天通过腹腔注射维甲酸，使精原细胞同步分化。由于分化后的细胞周期相对固定且同步，通过对维甲酸处理不同时间点的小鼠系列取材，可获得不同发育阶段的生精细胞。而未分化型精原细胞不受同步化的影响，为了避免其污染，该研究构建了生精细胞特异性携带红色荧光蛋白（Vasa-dTomato）的基因敲入小鼠模型和未分化型精原细胞特异性携带黄色荧光蛋白（Lin28-YFP）的基因敲入小鼠模型。红色单阳性的细胞即为同步化的目的细胞，可以通过单细胞采集系统Unipick获得单个细胞或FACS分选收集目的细胞群体。基于上述方法，该研究分离并鉴定了20类处于精子发生不同时期的细胞类型（图1），并利用高精度单细胞转录组测序的方法建立了上述不同发育阶段的转录组详细图谱。

图1：研究流程示意图及该研究中的20种生精细胞类型

生精细胞转录组的动态变化

通过对20个阶段的1,204个生精细胞进行高精度单细胞转录组测序，经过严格的质量控制后，剩余1,136个细胞用于后续的分析。基因表达数目结果显示，在整个精子发生过程中，生精细胞需要调动基因组近90%（20,088个基因中的18,037个）的蛋白质编码基因的表达（图2a）；与此同时，各阶段生精细胞转录水平存在明显的动态变化。其中晚粗线期与双线期精母细胞达到整个精子发生过程的转录峰值，而在晚细线前期与细线期阶段则为转录低谷期（图2a）。聚类结果显示，20类生精细胞可以划分为7大类。

有趣的是，同处于DNA复制的早细线前期与中晚期细线前期精母细胞被聚类到了不同的类群之中（C1与C2）（图2b），提示早细线前期（ePL）向中晚期细线前期（mPL）的转变可能是减数分裂过程潜在的重要转折点；同为圆形精子细胞的RS2（C5）、RS4与RS6（C6）和RS8（C7）则被分为三群，提示其功能可能存在显著差异。

图2：（a）箱式图展示了20个阶段的生精细胞中已知蛋白质编码基因的基因数量；（b）t-SNE分析将生精细胞划分为C1至C7共7个新类群

精子发生过程中关键调控因子的筛选与验证

图 3：（a）8周龄野生型小鼠睾丸和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的H&E染色结果；（b）8周龄野生型小鼠和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的免疫荧光染色结果。标尺：50 μm

精子发生过程中重要的转录因子

精子发生过程具有很强的阶段特异性，在不同阶段中有着不同的转录特征，而转录因子被认为是在精子发生过程中调节了基因表达的时空特异性。

为了寻找调控精子发生关键转变节点的转录因子，该研究分别分析了有丝分裂向减数分裂转变过程和减数分裂向精子形成转变过程中的转录因子共表达调控网络。共表达网络结果显示，c-fos/c-jun和Zfp316在有丝分裂向减数分裂转变过程中具有潜在的调控作用（图4a）。而在减数分裂向精子形成转变过程中，除已报道的在生精细胞发育过程中发挥着重要功能的Crem和Rfx2外，该研究还筛选出像Sox30和Zfp541这样未知的潜在转录因子（图4b）。

为了验证这些未知转录因子的作用，该研究对小鼠进行了Sox30基因的全局性敲除或生殖细胞特异性敲除。功能研究发现不论是全局性敲除的小鼠还是条件性敲除的小鼠，都表现为雄性不育。组织学H&E染色发现，Sox30基因敲除小鼠的精子发生表现为精子形成障碍，生精上皮内没有长形精子，少量的圆形精子细胞聚集形成多核巨型细胞。通过对顶体的染色，发现Sox30基因敲除小鼠的精子发生阻滞于圆形精子形成的第3~4步，提示Sox30基因在调控精子形成中的关键作用（图5a）。

为了探究Sox30调控精子形成的机制，研究人员从Sox30条件性基因敲除小鼠中获取了49个第3步圆形精子细胞用于单细胞转录组分析。Sox30基因敲除组和野生型对照组细胞内基因表达差异明显，存在两千多个差异表达基因（1,153个突变组下调基因和895个突变组上调基因）。通过对差异表达基因做GO分析发现，Sox30基因敲除组下调的基因与精子形成密切相关。为了进一步寻找受Sox30直接调控的下游靶基因，该研究开展了SOX30的ChIP-seq实验。通过与RNA-Seq的结果共同分析，在基因敲除组下调的基因中找到233个受Sox30直接调控的关键靶基因。通过GO分析发现，这些靶基因与精子形成密切相关，例如Chd5, Hils1和Sun5等（图5b）。