肿瘤坏死因子（TNF）超家族蛋白是一系列免疫细胞互相协调的关键蛋白。这个家族中的许多成员都成为了肿瘤免疫治疗的标靶。今天我们要说的TNFR2也是其中之一。

 

TNFR2的表达与结构

TNFR2，也叫CD120b或者p75，全名为 Tumor necrosis factor receptor 2，是肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员，能够通过富含细胞半胱氨酸的结构域结合肿瘤坏死因子（TNF）。

TNFR2是单程跨膜糖蛋白，由439个氨基酸组成，其中前235个氨基酸形成包含四个富含半胱氨酸基序的胞外结构，30个氨基酸形成跨膜结构域，后174个氨基酸形成具有TRAF2结合位点的胞内结构[1]。

TNFR2蛋白由TNFRSF1B基因编码。人TNFRSF1B基因位于1号染色体1p36.22。小鼠同源基因Tnfrsf1b位于小鼠4号染色体。

TNFR2的表达仅限于抑制性免疫细胞，尤其是调节性T细胞（Tregs），髓系抑制性细胞(MDSCs)，内皮细胞和生长过程中的选择神经元。此外，TNFR2也在肿瘤细胞中表达[2-4]。

 

TNFR2/TNF信号

TNFR2是TNF的受体之一。TNF有两种结构相关但功能不同的受体，TNFR1（p55）和TNFR2（p75）。与TNFR1主要负责TNF介导的细胞凋亡和死亡、诱发促炎反应不同，TNFR2虽然也能与可溶性sTNF结合，但与跨膜mTNF亲和力更高，且仅被mTNF完全激活并触发有效的信号转导，行使细胞存活和免疫抑制相关功能[5]。

在癌细胞和免疫抑制细胞中，当mTNF与TNFR2结合激活信号时，TNFR2通过激活NFκB诱导激酶（NIK）诱导NFκB的非规范性激活，进一步导致IKKα磷酸化和p100的加工，也是p52/RelB的核易位的关键步骤。TNFR2还招募TRAF2-cIAP1-cIAP2复合物。cIAP具有泛素连接酶活性，可以抑制caspases和其他凋亡诱导因子，从而激活规范性和非规范性NF-κB/Rel和MAPK信号通路。TNFR2信号分别通过RIPK1和Etk进行信号传导。RIPK1通过IkB激酶（IKK）复合物触发NF-κB，这使IL-2的表达被激活，以及与细胞存活和增殖正相关的几个基因的转录增加。TNFR2介导的Etk磷酸化能部分激活VEGFR2，进而激活了PI3K/Akt信号途径，不仅维持细胞存活并增强增殖，还招募Etk形成参与细胞粘附、迁移、存活和增殖的TNFR2-Etk-VEGFR2复合物。此外，它还会增强STAT5的磷酸化，这对免疫抑制具有关键作用[2,6,7]。

 

图1 . Signaling Pathways of TNFR （图片来自Ref.1）

 

TNFR2与Treg

Treg是一种典型的免疫抑制细胞，通过抑制效应T细胞增殖和细胞因子生成，从而抑制过度的免疫反应并维持免疫稳态。与人类Treg一样，小鼠胸腺CD4 + CD25 + Treg和外周CD4 + CD25 + Treg相对于CD4 + CD25 – Teff效应细胞均具有高水平的TNFR2表达，而TNFR1几乎检测不到[7]。研究表明，TNF/TNFR2信号对于在炎性环境中维持FOXP3表达以及小鼠Treg的稳定性至关重要。当TNFR2信号被激活时，会增强Treg的稳定性、对TCR刺激的响应、扩增以及功能。能促进Treg和效应T细胞产生IL-2，并提高Treg对IL-2的敏感性。 IL-2可以抑制Th17细胞分化以及TNFR2信号转导对Treg的作用。 在炎性条件下，膜结合型受体mTNFR2可能脱落为可溶型受体sTNFR2，sTNFR2中和TNF并阻碍IL-6的表达[3]。

 

图2 . TNFR2 信号激活的作用（图片来自Ref.3）

TNFR2与自身免疫性疾病

Treg的功能缺陷以及数量低下是各种自身免疫性疾病的主要特征。因此，恢复适当的功能性Treg利于诱导免疫耐受已成为治疗自身免疫性疾病的主要目标。如上文所述，TNFR2激动剂具有增强Treg增殖和活化的作用。在包括T1D、SLE、IBD和MS在内的多种人自身免疫性疾病中都发现了TNF-TNFR信号通路的受损。如T1D患者的TNFR2+ Treg更高。 在使用TNFR2激动型抗体治疗T1D的研究中发现了TNFR2激动剂可以杀死致病性自身反应性CD8 T细胞，这表明诱导TNF-TNFR2途径是选择性杀死自身反应性T细胞的有效方法[8]。

 

 

图3. 在自身免疫性疾病的组织部位，Treg细胞太少，Teff细胞或细胞毒性T细胞太多。TNFR2激动剂可以改变这种异常的微环境并将其转变为非疾病状态。（图片来自Ref.7）

TNFR2与肿瘤免疫治疗

TNFR2除了维持Treg增殖和稳定的作用以外，还起着癌基因的作用。目前已在至少25种肿瘤中确定了TNFR2的表达，如人类肾细胞癌、多发性骨髓瘤、结肠癌、卵巢癌、皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）等[4,7]。肿瘤微环境会狡猾地招募具有高免疫抑制力的TNFR2+ Treg细胞，从而促进肿瘤免疫逃逸。转移性黑素瘤患者中的Treg细胞TNFR2基因表达上升与CD8细胞毒性T细胞耗尽有关。TNFR2基因敲除小鼠对肿瘤表现出增强的免疫应答，肿瘤生长放缓。这可能是由于缺乏TNFR2+ Treg，或未能发展出全身性自身免疫，或MDSC数量减少和功能受损[4]。因此，利用TNFR2拮抗剂抑制Tregs，恢复肿瘤免疫应答并消除肿瘤，成为了肿瘤免疫治疗的又一策略。

 

 

图4. TNFR2 + Treg在肿瘤免疫中的作用（图片来自Ref.11）

 

体外研究表明，TNFR2拮抗型抗体可以抑制卵巢癌细胞以及与肿瘤相关的Treg的增殖[9]；晚期Sézary综合征中表达TNFR2的肿瘤细胞可以被TNFR2拮抗型抗体消除，同时TNFR2拮抗型抗体还杀死了TNFR2+ Treg，通过抑制Treg扩增Teff将Treg/Teff比调节至正常水平[4]。

 

图5. TNFR2拮抗型抗体阻断TNF/TNFR2轴对肿瘤免疫治疗的作用（图片来自Ref.10）。（A）TNFR2在癌细胞和抑制性免疫细胞（包括Treg和MDSC）上表达。 TNF与TNFR2结合后通过Treg和MDSC的扩增导致肿瘤细胞的增殖和免疫逃逸，并抑制效应Teff细胞的免疫应答。 （B）通过TNFR2抗体对TNFR2的阻断逆转这种情况，促进Teff对抗肿瘤细胞的免疫功能。

 

图6. 靶向TNFR2的纳米颗粒对肿瘤细胞以及Treg的作用模型（图片来自Ref.6）。通过基于特定配体可靶向肿瘤细胞的纳米粒子将TNFR2抗体运输到肿瘤微环境中释放，从而阻断肿瘤细胞和Tregs上的TNFR2，抑制Tregs并激活Teff，最终达到减少肿瘤发生、侵袭和转移的治疗目的。

 

TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）的建立、验证与应用

 

品系全名	C57BL/6J-Tnfrsf1bem2(hTNFRSF1B)Smoc
目录号	NM-HU-190010
基因名	Tnfrsf1b
品系描述	利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，南模生物自主研发TNFR2人源化小鼠模型，将小鼠Tnfrsf1b基因替换为人源TNFRSF1B基因，从而表达人TNFR2蛋白，取代小鼠内源Tnfr2蛋白的表达。

 

TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）的表达验证

杂合子和纯合子TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）脾脏Treg细胞和中性粒细胞中均可检测到hTNFR2的活跃表达。

 

图7. FACS检测TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）脾脏细胞人源hTNFR2的表达。

杂合子和纯合子TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）外周血Treg细胞和中性粒细胞中均可检测到hTNFR2的活跃表达。

 

图8.  FACS检测TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）外周血细胞中人源hTNFR2的表达。

杂合子TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）淋巴结细胞中可检测到hTNFR2的活跃表达。

图9. FACS 检测TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）淋巴结细胞人源TNFRSF1B的表达。

 

TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）在药效评价中的应用

TNFR2人源化小鼠（TNFRSF1B-HU）MC38-OVA荷瘤模型中，两种anti-hTNFR2抗体均表现出显著的抗肿瘤疗效。

 

图10. In vivo efficacy evaluation of anti-hTNFR2 in TNFR2 humanized mice (TNFRSF1B-HU) with MC38-OVA tumors

FACS分析anti-hTNFR2抗体治疗后TNFR2人源化小鼠（TNFRSF1B-HU）MC38-OVA荷瘤模型血液中各类淋巴细胞的比例。

 

图11. FACS for blood upon TNFR2 antagonist treatment.

FACS分析anti-hTNFR2抗体治疗后TNFR2人源化小鼠（TNFRSF1B-HU）MC38-OVA荷瘤模型肿瘤浸润淋巴细胞比例。

 

图12. TIL analysis upon TNFR2 antagonist treatment. 

 

TNFR2拮抗剂可通过消除肿瘤微环境中的Treg并激活Teff来恢复T细胞平衡。

 

图13. TNFR2 atagonists can restore the T cell balance by eliminating Treg and activating Teff in tumor microenvironment.

 

References

1. Ortí-Casañ N, Wu Y, Naudé PJW, De Deyn PP, Zuhorn IS, Eisel ULM. Targeting TNFR2 as a Novel Therapeutic Strategy for Alzheimer's Disease. Front Neurosci. 2019 Feb 4;13:49.

2. Vanamee ÉS, Faustman DL. TNFR2: A Novel Target for Cancer Immunotherapy. Trends Mol Med. 2017 Nov;23(11):1037-1046.

3. Yang S, Wang J, Brand DD, Zheng SG. Role of TNF-TNF Receptor 2 Signal in Regulatory T Cells and Its Therapeutic Implications. Front Immunol. 2018 Apr 19;9:784.

4. Torrey H, Khodadoust M, Tran L, Baum D, Defusco A, Kim YH, Faustman DL. Targeted killing of TNFR2-expressing tumor cells and Tregs by TNFR2 antagonistic antibodies in advanced Sézary syndrome.  Leukemia. 2019 May;33(5):1206-1218.

5. Medler J, Wajant H. Tumor necrosis factor receptor-2 (TNFR2): an overview ofan emerging drug target. Expert Opin Ther Targets. 2019 Apr;23(4):295-307.

6. Al-Hatamleh MAI, E A R ENS, Boer JC, Ferji K, Six JL, Chen X, Elkord E, Plebanski M, Mohamud R. Synergistic Effects of Nanomedicine Targeting TNFR2 and DNA Demethylation Inhibitor-An Opportunity for Cancer Treatment. Cells. 2019 Dec 20;9(1). pii: E33.

7. He, Xuehui & Wang, Xinhui. (2019). TNFR2 and Regulatory T Cells: Potential Immune Checkpoint Target in Cancer Immunotherapy. 10.5772/intechopen.85632.

8. Faustman DL. TNF, TNF inducers, and TNFR2 agonists: A new path to type 1 diabetes treatment. Diabetes Metab Res Rev. 2018 Jan;34(1).

9. Torrey H, Butterworth J, Mera T, Okubo Y, Wang L, Baum D, Defusco A, Plager S, Warden S, Huang D, Vanamee E, Foster R, Faustman DL. Targeting TNFR2 with antagonistic antibodies inhibits proliferation of ovarian cancer cells and tumor-associated Tregs. Sci Signal. 2017 Jan 17;10(462):eaaf8608.

10. Al-Hatamleh MAI, Ahmad S, Boer JC, Lim J, Chen X, Plebanski M, Mohamud R. A Perspective Review on the Role of Nanomedicine in the Modulation of TNF-TNFR2 Axis in Breast Cancer Immunotherapy. J Oncol. 2019 May 23;2019:6313242.

11. He J, Li R, Chen Y, Hu Y, Chen X. TNFR2-expressing CD4+Foxp3+ regulatory T cells in cancer immunology and immunotherapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 2019;164:101-117.