Cre小鼠因其广泛的应用而备受青睐。依据Cre-LoxP系统的原理，当Cre小鼠与携带Floxed序列的各类小鼠（包括但不限于条件性敲除小鼠，泛指所有含有loxP位点的小鼠）进行交配后，子代小鼠中表达Cre酶的组织细胞将经历特定的基因重组，使Floxed序列实现敲除或反转等改变。

Fig 1. The schematic below shows the three types of rearrangements: inversion, deletion and translocation.

很多科研工作者希望使用其在特定组织细胞中提供的Cre重组酶来实现课题设计中预期的特异性重组。但是，在实际应用过程中，许多研究者都发现，Cre小鼠的Cre酶不像预期中一样“可控”——在部分Cre小鼠的配繁过程中，可能会检测到一些“非预期的重组”。遇到这种情况时，研究者需要考虑，小鼠是否发生了生殖系重组，即种系重组。

在具体介绍种系重组的概念之前，我们先来看一个案例。

Fig 2. Nonspecific Expression of a Reporter Gene from a Genetic Cross of Oprk1^Cre/wt; Rosa26^{lox-stop-lox-tdTomato/wt} with a Wild-Type Mouse^[1]. 

上图中的两只小鼠来自相同的亲本小鼠。

子一代：使用Cre品系 (GeneX^Cre/wt) 与有LSL结构的报告基因小鼠 (Reporter^Lox/wt) 杂交，得到雌雄双杂子代 (GeneX^Cre/wt；Reporter^Lox/wt)。

子二代：使用雌雄双杂小鼠分别与雄雌野生型小鼠杂交。

左侧小鼠在进行基因型鉴定时发现其没有Cre基因表达，但外观可见明显红色荧光表达；右侧小鼠为左侧小鼠的同窝对照，基因型鉴定发现其为正常的双杂子代小鼠。通过进一步的脑组织切片后观察其荧光表达发现，左侧小鼠脑组织中有广泛的红色荧光，且在不同细胞中（在血管处）观察到了非特异红色荧光表达；而右侧小鼠则仅观察到目的细胞特异的红色荧光表达。

很明显左边的小鼠发生了“非预期重组”，也就是我们前面提到的种系重组。

种系重组一般发生在亲本小鼠（无论雌雄）基因组中同时有Cre基因和Floxed序列表达的时候。之所以会发生种系重组，是因为在某些Cre小鼠中，Cre重组酶会在其生殖系细胞中表达（如睾丸、卵巢），而Cre酶介导的重组可能发生在配体发生的二倍体阶段，这种情况下产生的单倍体子细胞形成的胚胎发育得到的子二代小鼠，即使没有Cre酶基因的表达，依然可能可以观察到报告基因的表达。

种系重组的发生会导致我们预期只在特定类型细胞中的重组广泛发生在子代小鼠体内，若我们及时进行检测发现这些问题，可能导致我们的课题研究从根本上存在漏洞（毕竟若发生了种系重组，Cre阴性的小鼠也可能已发生了广泛重组，而Cre阴性的小鼠在很多课题中被用作对照组）。

CKO及CKI中的检测

对于Floxed品系来说，基因型鉴定的常规引物一般设计在其loxp位点的上下游（即下图B，C中a，b引物），以确认其loxp位点是否已发生预期插入。这种鉴定对于Floxed品系小鼠单品系繁育是足够的，但若与Cre品系小鼠配繁后使用，仅使用这一组引物进行基因型鉴定，可能会“误检”部分子代小鼠的基因型。

如下图B中第二泳道中样本为+/+（野生型），而第六泳道中样本则为+/-（由于发生了种系重组，导致该小鼠一半染色体上的Floxed序列已经发生了重组，即敲除，导致其无法被检测到。而另一半染色体上无loxp位点插入），这两种基因型的小鼠在目的基因的表达上是有很大差异的，但若仅通过a，b引物来进行基因型鉴定，会导致很大的误差。

Fig 3. Breeding and Genotyping Strategies for Conditional KO/KI Mice^[2].

使用Floxed品系与Cre小鼠配繁后，在进行常规的loxp位点插入鉴定（引物a,b）的基础上，补充进行Cre酶是否发挥作用的鉴定（引物c）是非常重要的。这里不仅要关注Cre酶是否发挥作用，同时也要关注Cre发挥作用后，Loxp位点是否仍然存在（一般我们进行基因型鉴定所选取的组织中都会包含两部分细胞，一部分细胞中表达Cre重组酶，另一部分细胞中不表达。因此我们的鉴定结果中理论上都应该能够检测到确定Loxp位点敲入的条带，即图B中的“Flox”位置条带和图C中的“KI”条带）。

对每个子代的基因型进行WT、Floxed和KO/KI/Rec等位基因的检测，是确保所有动物都有其预期的基因型的唯一方法。如果观察到重组等位基因，想要确认是否发生了种系重组，可以通过检测Cre阴性的子代来排除鼠尾或鼠耳中有Cre表达时会观察到的嵌合重组的现象。重点是减少非预期重组，由于存在不同靶基因对Cre重组酶的敏感差异，因此细胞类型特异性的重组模式也必须在感兴趣的靶基因位点上进行确认，而不仅仅是在一个单独的报告基因位点上。因此，通过原位杂交和/或免疫染色来验证感兴趣区域的目标对于确认细胞类型的特异性和局部重组的效率非常重要。

种系重组相关的知识比较复杂，请关注我们。我们将会在后续的推文中持续为您介绍，请如Cre品系与报告小鼠配繁相关的种系重组问题、嵌合重组及受精卵重组与种系重组的区分等。