无论你是“E人”或是“I人”，今天我们都是“P人”
最近很火的MBTI测试不知道大家都测试过了吗？那么你是开朗外向的“E人”呢，还是善于观察思考内向的“I人”呢？
MBTI测试将人的性格分为了16型，主要包括四大类：分析型、稳健型、和谐型、自由型，有的人可能适合投身科研领域成为伟大的科学家，而有的人可能逻辑性强，责任心重具备成为leader的潜质，再有的人可能感情细腻，富有同情心投身医疗、教育事业……无论你是哪种人，看完今天的知识点，保证你会是一名合格的“P人”。
看到这里的小伙伴都会有疑问了
什么是P人呢？
P就是在我们日常实验，尤其是小鼠实验中的各种PCR包括：PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR等。下面我就一一为大家讲解。
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1976年，中国科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。主要反应步骤可以总结为：高温变性，低温退火，中温延伸。
① 高温变性：通过高温（约95℃）加热一定时间，将模板DNA解离成单链的形式，以便与引物结合；② 低温退火（复性）：降温至约55℃时，引物与模板DNA单链按照碱基互补配对原则结合；③ 中温延伸：再将温度调至约72℃（适合DNA聚合酶反应的温度），在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板和引物结合物沿着磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向，按照碱基配对和半保留复制原则合成一条新的、与模板DNA链互补的半保留复制链。通过经历变性、退火和延伸几个循环后，待扩增的基因可以被扩增放大几百万倍（1）。
这类PCR在小鼠中主要用于基因敲除和敲入小鼠等转基因生物的基因型鉴定（2）。
当然在开始PCR前DNA的抽提将决定整个实验的成败，DNA的抽提方法及后续建议使用浓度可以参考我们之前的推文：
https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2382/post_type/1.html
在反应过程中有的时候会发现出现了非预期条带，那么可能是您的反应体系存在污染，这部分内容之前我们也有详细的介绍如何避免污染哦：https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2384/post_type/1.html
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。
1
TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
2
SYBRGreenⅠ荧光染料法：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图
PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）
数据分析
通过实时荧光收集到的信号，仪器会自动绘制荧光曲线，通常5-15个循环的荧光信号都属于背景信号，然后将其设置为扩增曲线的背景或基线。在理想条件下，PCR产物量呈指数倍增长Yn=Y0×2^n（X0：初始模板量，n：PCR循环次数，Yn：第n次循环后的产物量）。但实际上可能引物模板引物消耗完，DNA聚合酶逐渐失活等原因，产物量就恒定。荧光强度就呈“S型”曲线即“扩增曲线（Amplication plot）”，分为基线期、指数增长期和平台期。再根据待测样品的Ct，可计算样品拷贝数/浓度。通常模板每稀释10倍，CT值增大3.33。如果研究基因表达量通过比较达到设定荧光阈值所需的Ct值大小，可以比较出基因表达量的高低。
qPCR主要应用：
普通基因表达水平的检测：能够快速准确的定量出相关基因在不同组织或生命状态下的相对表达水平，例如：CKO小鼠敲除效率的检测。2、基因拷贝数的检测：能够准确的定量出相关基因在染色体中的拷贝数。
3、特殊RNA的转录水平检测：根据特殊RNA的结构，如microRNA、circRNA等，设计其特殊引物，如茎环结构引物、反向引物等，对这类RNA的转录水平进行定性、定量分析。
RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。整个反应过程分为两步，第一步是经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA的过程；第二步是以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增目的片段的过程。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发夹结构的真核细胞mRNA，3种都可（3）。
RT-PCR其操作方法分为两种，即一步法和两步法。一步法RT-PCR，逆转录同PCR扩增结合在一起，即cDNA合成与PCR扩增反应在同一管Buffer及酶中进行，一步完成。两步法RT-PCR，RNA首先在反转录酶的作用下生成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，分成两步进行。
RT—PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。
RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。
RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究（4）。
希望这篇“P文”能对您的实验有一定帮助，让您成为一个合格的“P人”。最后，大家如果不想在PCR鉴定上浪费时间，南模生物也可提供大小鼠基因型鉴定服务，更多详情请联系我们。
1.多重聚合酶链式反应技术研究和应用．中国知网
2.Nobel Media AB (2014) The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine - Advanced Information. nobelprize.org
3.胡奇林，林锋强，陈少莺等. 应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒．《中国兽医学报》，2004
4.Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.
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