老套路新玩法，关于Cre鲜为人知的一面
你一定听说过Cre-lox重组系统，无论你是否直接进行过基因操作。由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率高的优点，如今已经成为体内外遗传操作的强有力工具。利用Cre-lox系统，可以在特定细胞、组织或整个生物体，甚至在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和人类疾病动物模型的建立都具有深刻影响。
传统的Cre-lox系统虽然可以特异性的标记目的细胞的靶基因。同时后续也可以通过CreERT2的方式，实现时间上对Cre的控制。但是在使用过程中还是常常遇到各种问题：单基因是否能特异性的标记某类细胞？他莫昔芬诱导要不要考虑代谢问题，毒性问题呢？万一这类细胞找不到合适的靶基因又该怎么呢？今天小编为您细说Cre-lox系统的老套路和新玩法。
老套路
环化重组酶（Cre, cyclization recombinase），是酪氨酸位点特异性重组酶之一，能催化两个DNA识别位点之间的位点特异性重组。Cre重组酶来源于P1噬菌体，由 343个氨基酸组成，能特异性地识别Lox位点。
Cre重组酶识别的回文DNA位点，也叫loxP (locus of X-over P1) 位点，长34bp，其特征结构为ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT，两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列。
合理利用Cre-Lox系统可以实现对基因的操控，根据您的需求进行基因的条件性表达或和条件性敲除。关于Cre-lox系统的原理与基本应用，我们官网上有详细介绍哦，具体链接→Cre-lox系统介绍及使用汇总，感兴趣的点击了解吧。
新玩法
基于小鼠的Cre-lox系统应用
早在2003年 Jean-Paul Herman团队就提出Cre酶由于缺乏对其活动的有效时间控制，它的实用性仍然受到限制，后来他们开发了 DiCre，一种用于 Cre 的可调节片段互补系统。Cre酶被分成两个部分，分别与 FKBP12（FK506 结合蛋白12）和 FRB（FKBP12-雷帕霉素相关蛋白的结合域）融合，再通过雷帕霉素的诱导快速重组，利用雷帕霉素与FKBP12和FRB结构域结合后，可以直接诱导这两个结合结构域的异二聚化的原理，实现Cre酶的时间调控（Nicolas Jullien et al., Nucleic Acids Res. 2003）。
Principles of the DiCre system. (A) Scheme of the DiCre system. The enzyme is split into two fragments without enzymatic activity, that are fused to proteins (here FKBP12 and FRB) that can be dimerized by a small molecule ligand. Dimerization leads to the association of the complementing Cre moieties and the reconstitution of enzymatic activity. (C) Schematic representation of the constructs used for DiCre. The translation initiation codon has been placed into the context of Kozak’s consensus sequence. NLS corresponds to a nuclear localization signal peptide. The unique NheI (N) and BamHI (B) sites flanking the linker sequence allow its simple replacement with variants.
2009年Frank Kirchhoff团队针对Cre/loxP系统单基因的表达模式存在不特异性的问题，且单启动子不足以从遗传学上定义不同的神经细胞类型，他们在上述研究基础上改进了DiCre，并重新定义为“split-Cre”系统。具有 N 端或 C 端 Cre 片段的分别融合到酵母转录激活因子 GCN4 的组成型二聚化卷曲螺旋亮氨酸拉链域中（两个拉链区可以由α螺旋一侧的Leu之间的疏水作用形成拉链，并以α螺旋超卷曲的连接方式形成二聚体），分别定义为NCre 和 CCre，通过GCN4的二聚化实现Cre的重组。在此结构的基础上连接上不同基因的启动子，实现在发育过程中 NCre 和 CCre 的短暂但同时表达的细胞才具有Cre活性（Johannes Hirrlinger et al., PLoS One. 2009）。
A: Principle of split-Cre complementation. NCre- and CCre-coding sequences are placed under the control of two different promoters (promoter 1 and 2, respectively). Only if both promoters are active, functional complementation takes place and LoxP (red triangles) – flanked sequences are recombined, thereby activating reporter genes (A1) or excising exons for knock-out strategies (A2). Ubi: ubiquitously expressed promoter (in our study the ROSA26 promoter). B: Design of fusion proteins. NCre- and CCre-proteins were constructed by fusing amino acids 19–59 (NCre) or amino acids 60–343 (CCre) of the sequence of Cre recombinase to the constitutive active coiled-coil interaction domain of the yeast transcription factor GCN4 (GCN4cc). Immunotags (Flag, Myc), a linker sequence as well as a nuclear localization sequence (NLS) were also added.
两个研发团队通过不同的方式都实现了对Cre活性的调控，“split-Cre”系统可以说是在DiCre基础上做了完善，实现了Cre作用的更精准更特异，但是却舍弃了DiCre实现对Cre时间上的调控的设计初衷，随着技术的发展CreERT2进入了人们的视野，但是化学诱导不可避免存在一定的毒性，这个问题对一些药物敏感性实验成为了致命打击。
2020年Haifeng Ye团队针对化学诱导毒性问题，并结合前人研究，提出了新的系统远红光诱导分裂Cre-loxP系统-FISC系统。该系统将Cre的N端融合到Coh2结构域，Cre的C端与DocS结构域融合，并由远红外光（FRL）响应启动子pFRLx驱动，在FRL光照下，基于Coh2和DocS结构域的强亲和力，当将两个片段结合在一起时，Cre酶才能拥有重组酶活性，行使相应功能（Jiali Wu et al., Nat Commun. 2020）。
Design and optimization of the far-red light-induced split Cre-loxP system (FISC system). Schematic representation of the FISC system. Cre recombinase was split into two fragments: CreN59 (residues 1–59) fused to Coh2 driven by a constitutive promoter (PhCMV) and CreC60 (residues 60–343) fused to DocS driven by the far-red light (FRL, 730 nm)-inducible promoter (PFRLx). Upon FRL illumination, the photoreceptor BphS is activated toconvert intracellular guanylate triphosphate (GTP) into cyclic diguanylate monophosphate (c-di-GMP). The cytosolic c-di-GMP production induces bindingof the far-red light-dependent transactivator FRTA (p65-VP64-BldD) to its synthetic promoter PFRLx to drive DocS-CreC60 expression. Consequently, the catalytic activities of Cre recombinase can be restored once the two Cre fragments assemble based on affifinity interactions of their respective Coh2 and DocS fusion domains, enabling to excise DNA sequences flflanked by loxP sites
以上研究都是基于小鼠为研究模型对Cre-loxP系统的不同应用，南模生物可提供超过300多种自主产权Cre工具鼠，覆盖全身各类型的细胞组织，满足科研人员多样化的需求。同时，南模生物长期提供Cre工具鼠定制服务，可按具体实验要求进行定制，满足不同实验室需求。
基于AAV的Cre-lox系统应用
固然，根据具体实验方案定制培育Cre小鼠是更贴合实验需求的方式，但定制Cre小鼠不仅费时而且昂贵，且管理多种Cre小鼠品系更是繁琐易错，那么这一问题又该怎么解决呢？
重组腺相关病毒载体(AAV)介导的Cre-loxP系统很好的解决了上述问题，将目的元件包括启动子和增强子，以及内含子、微小 RNA 识别序列和内部核糖体进入位点（IRES或2A），重组酶（Cre、CreER、Flp 或 FlpER），翻译后调控元件，如 WPRE 或 3'-UTR等，构建出特异性组织或者细胞表达的Cre工具鼠（Leila Haery et al., Front Neuroanat. 2019）。
Several aspects of experimental design affect neuronal targeting and manipulation including (A) viral delivery method, (B) composition of viral capsid proteins, (C) promoters and/or enhancers driving transgene expression, (D) IRES or 2A elements for multicistronic expression coupled with fluorescent proteins (FP) or protein epitopes, (E) post-translational regulatory elements such as WPRE or 3′-UTR, and (F) Recombinase (Cre, CreER, Flp, or FlpER) expression from transgenic driver lines (inserted genomically via targeted or random integration) and ligand-dependent or recombinase-dependent expression elements such as TRE or lox sites, respectively. Abbreviations: TRE, tetracycline-response element; lox, LoxP sequence; IRES, internal ribosomal entry site; 2A, 2A sequence for self-cleavage; FP, fluorescent protein; WPRE, woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element; 3′-UTR, 3′-untranslated sequence.
但是AAV转导的效率和特异性也会受到很多因素的影响，比如说：给药的途径、AAV血清型、AAV滴度和给药剂量等，同时哺乳动物的基因转录的调控元件通常分布在数千到数十万个碱基上，但是AAV 基因组的包装能力是有限的（小于5kb），所以识别与 AAV 兼容的启动子一直具有挑战性。这些也都使AAV介导Cre-loxP系统受到了一定的限制，所以到底是用老鼠或是AAV还是要视情况而定的。
南模生物利用AAV介导的Cre-flox系统构建了丰富的动物模型，部分验证数据如下：
小鼠肺癌模型
由气管雾化注射AAV-Cre病毒至KL小鼠(NM-CKO-234719)肺部，使Cre在小鼠肺部特异性表达，诱导Stk11表达缺失与Kras-G12D突变，可诱发肺癌发生。
小鼠PKD运动障碍模型
腺相关病毒介导 Cre 在小脑内局部敲除 Prrt2 表达，导致热诱导性运动障碍的发作。
南模生物Find Cre®数据库
南模生物深耕基因修饰动物模型行业二十余年，为快速精准地选择合适Cre工具鼠，特推出Find Cre®数据库。该数据库包含超过300多种自主产权Cre重组酶工具鼠，以小鼠组织、器官和系统为主线，可分为肺、肝、胃肠道、乳腺、胰腺、感觉器官、心血管系统、免疫系统、神经系统、泌尿生殖系统、骨骼肌系统以及其他组织器官。大家只要选择自己感兴趣的组织器官，就可以查看该组织下可用的Cre工具鼠。
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参考文献：
Nicolas Jullien et al. Regulation of Cre recombinase by ligand-induced complementation of inactive fragments. Nucleic Acids Res. 2003 Nov 1;31(21):e131. doi: 10.1093/nar/gng131.
Johannes Hirrlinger et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 2009;4(1):e4286. doi: 10.1371/journal.pone.0004286. Epub 2009 Jan 27.
Jiali Wu et al. A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun. 2020 Jul 24;11(1):3708.doi: 10.1038/s41467-020-17530-9.
Leila Haery et al. Adeno-Associated Virus Technologies and Methods for Targeted Neuronal Manipulation. Front Neuroanat. 2019 Nov 26:13:93.doi: 10.3389/fnana.2019.00093. eCollection 2019.
Tan GH, Liu YY, Wang L, et al. PRRT2 deficiency induces paroxysmal kinesigenic dyskinesia by regulating synaptic transmission in cerebellum. Cell Res. 2018;28(1):90-110. doi:10.1038/cr.2017.128
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Cre-ERT2在无Tamoxifen诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT（雌激素类似物）与ERT结合，可使Cre-ERT2进核发挥Cre重组酶活性。
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