图2. 荧光蛋白发展史 (A)， FPs的系统发育树（B）

荧光蛋白的分类

表1. 通用荧光蛋白参数表

RFPs（红色荧光蛋白）：

• mCherry具有优异光稳定性，是最通用红色单体（但融合表达时有较弱的齐聚效应）

• tdTomato具有mCherry相同的光稳定性，亮度更强，是追踪表达水平的理想选择，但为串联二聚体，可以在融合标签大小不干扰蛋白质功能的情况下使用

• mStrawberry是最亮的红色单体，但光稳定性要弱于mCherry

• DsRed是细胞毒性最小的RFP

• mApple在蛋白的融合表达中是mCherry理想的替代物，但其光稳定性要远弱于mCherry

• mKate2从参数方面考量是综合亮度、光稳定性和齐聚性的最佳RFP，但目前报道相对较少

OFPs（橙色荧光蛋白）：

• mOrange是最亮的橙色单体

YFPs（黄色荧光蛋白）：

• YPet具有极高的光稳定性且成熟快,亮度极高

• mVenus是亮度极高的黄色单体

GFPs（绿色荧光蛋白）：

• EGFP是目前适用范围最广的FP，综合多个优势属性

• GFP是最早发现的荧光蛋白，应用广泛

CFPs（青色荧光蛋白）：

• mTurquoise是最亮的青色单体

• CyPet是最稳定的CFP

BFPs（蓝色荧光蛋白）：

• mTagBFP2是最稳定，成熟极快、亮度极亮的蓝色单体

荧光蛋白选择八要素

• 激发波与发射波——我们选择的光学系统需能够有激发FP合适的激发光，并同时有检测FP发射光的合适通道

• 齐聚度——融合表达时，选择易齐聚的FP可能会影响其融合蛋白的生物学功能或定位，此时应尽量选择单体FP

• 亮度——选择足够亮的FP才能提供足够信号以便检测和成像

• 光稳定性--FP应具有足够的光稳定性以使其稳定成像

• 成熟时间--FP正确折叠并形成发色基团所需的时间

• pH稳定性--某些FP随着pH的变化会改变荧光强度，可用于检测pH变化/胞吐作用

• 分子氧--许多FP上的发色基团成熟需要氧气，因此该类FP不能在缺氧环境使用

• 温度--FP的成熟时间和荧光强度会受到温度的影响，需根据实验温度环境选择FP

有了上文提到的八要素评价体系后，我们就该考虑在实际实验中如何运用这些荧光蛋白。

荧光蛋白应用示例

将示踪基因敲入到小鼠内源基因的或5'端或3'端，且与内源基因融合表达，可以确定内源蛋白的亚细胞定位（如图3所示）。荧光标签插入位置的决定因素：1. 已有文献的报道，首先考虑已有的参考模型；2. N端或C端有无蛋白修饰，避免插入的位置进行蛋白翻译后的修饰；3. 离主要功能域远的N端或C端，确保蛋白正常功能的行使。总之，荧光标签插入的位置应尽量避免影响蛋白的正常功能。

图3 用于蛋白亚细胞定位研究的小鼠模型构建示意图

例如，中科院生化所张雷、周斌等[6]发现Vgll4基因全身敲除小鼠大部分会出生前死亡，而少部分存活的小鼠体型偏小、有严重的心肌肥大，还伴有心脏血液回流以及心脏瓣膜异常增厚等症状。随后他们通过构建Vgll4-EGFP荧光示踪小鼠观察Vgll4基因的表达时间及亚细胞定位（如图4所示），发现Vgll4基因从胚胎期的13.5天开始表达在小鼠主动脉瓣、肺动脉瓣间充质细胞的细胞核中，并持续表达在成体心脏动脉瓣膜的间充质细胞中。这些结果首次阐明了作为Hippo信号通路拮抗剂的VGLL4在心脏瓣膜发育以及稳态调节过程中的重要功能，为心脏瓣膜疾病的预防和治疗提供了新的靶点。

图4 Vgll4-GFP融合蛋白的亚细胞定位检测

常见的有两种方式。第一种方式是，将荧光示踪基因通过2A（自剪切多肽）或IRES（内部核糖体进入位点序列）敲入到小鼠内源基因的3'端，对内源基因表达进行示踪（如图5所示）；第二种方式是，将荧光基因敲入到小鼠内源基因的5'端，通过终止序列polyA与内源基因连接，可以实现内源基因的替代表达，通过观察荧光示踪基因的表达了解内源性蛋白的表达情况，例如：是否表达、表达量、表达组织分布等等。

图5 用于蛋白表达谱研究的小鼠模型构建示意图

例如，为寻找激活褐色脂肪细胞的小分子物质，研究人员在褐色脂肪成熟标志物解偶联蛋白(UCP1)终止密码子前定点敲入绿色荧光蛋白(GFP)表达框，建立了成熟褐色脂肪组织细胞荧光示踪的小鼠模型（如图6所示）。随后作者喂食荧光示踪小鼠1000余种临床用药通过观察荧光强度来检测体内Ucp1基因的表达水平，结果发现sutent能显著促进褐色脂肪细胞中UCP1的表达。本研究结合荧光标记的基因示踪小鼠模型和大规模化合物筛选，建立了一个筛选调控褐色脂肪组织细胞激活剂的高效实验体系，也为肥胖及相关代谢型疾病研究提供了新的思路[7]。

图6. Ucp1-2A-GFP荧光示踪小鼠的构建及褐色脂肪组织荧光强度的检测

 4.3   用于细胞系示踪的研究‍

利用Rosa26-LSL-reporter示踪小鼠，与特定细胞标记基因敲入Cre的工具小鼠交配，在子代小鼠中特定类型细胞被永久标记上报告基因荧光（如图7所示），通过观察这些被标记上的荧光信号可以追踪某类特定细胞及其后代所有细胞的增殖、分化以及迁移等活动，为研究细胞命运及谱系提供有力手段。

图7. 用于细胞谱系示踪研究的小鼠模型构建示意图

例如，研究人员利用基于Cre-loxP和Dre-rox双同源重组的报告基因小鼠R26-RSR -LSL-tdTomato，并结合能特异性标记CC10+细胞的Scgb1a1-CreER小鼠和特异性标记SPC+细胞的Sftpc-DreER小鼠，通过交配获得Scgb1a1-CreER;Sftpc –DreER ; R26-RSR-LSL-tdTomato（BASCs tracer）三基因型小鼠来特异性标记CC10+SPC+BASCs。通过体内验证，此策略能特异性地标记示踪BASCs。研究发现位于支气管肺泡交界处的BASCs（肺支气管肺泡干细胞）具有多种肺上皮细胞分化的潜能，并结合多种小鼠损伤模型揭示了这群干细胞在体内具有再生肺脏的能力，为肺脏的修复和再生研究提供了新的研究方向及理论基础[8]。

图8. 基于双同源重组系统的BASCs遗传谱系示踪

无论在融合表达还是非融合表达实验中，我们时常会面临需要选择多个荧光蛋白进行共成像的实验需求，例如追踪多基因表达水平、亚细胞定位、研究蛋白互作和细胞筛选等。

图9 荧光蛋白用于多色实验

选择荧光蛋白进行多色实验时除了考虑上述提到的基本八要素，还要兼顾荧光蛋白的兼容性。其中，选择兼容荧光蛋白遵守的原则是：选择不同荧光的峰值激发波长和峰值发射波长都应分开50-60 nm以上。

例如，CFP（ex 430 nm / em 474 nm）和YFP（ex 514 nm / em 527 nm）可以一起成像，但CFP和GFP（ex 488 nm / em 507 nm）在显示时会存在一些串扰。

目前一些比较常用的多色FPs组合：

双荧光（绿-红）：

EGFP+mCherry

EGFP+tdTomato

EGFP+mKate2

双荧光（青-黄）：

CyPet+YPet

三荧光（蓝绿红/青黄红）：

mTagBFP2+EGFP+mCherry

mTagBFP2+EGFP+tdTomato

mTagBFP2+EGFP+mKate2

CyPet+YPet+mCherry

CyPet+YPet+mKate2

希望今天的干货分享对每一位荧光蛋白的使用者有所帮助，在选择荧光蛋白时，不再迷茫！

参考文献：