SNP 在人类基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基对中就有一个多态位点，估计其总数可达300万个甚至更多[2]。当SNP发生在基因编码区或基因的调节区域时，它会对基因表达产生巨大的影响，从而影响基因的功能。有一些SNP位点已被证明在人类健康研究中非常重要，例如镰状细胞贫血、β地中海贫血和囊性纤维化的发生主要是由于SNP的出现。同时，研究人员发现，SNP可能有助于预测个体对某些药物的反应、对毒素等环境因素的易感性以及罹患特定疾病的风险。例如，携带有APOE(载脂蛋白)ε4突变的个体表现出患阿尔茨海默病的更高风险[3,4](图3)。

图3 APOE4促进病理性tau蛋白的再分配。

a：人源APOE敲入小鼠海马体tau蛋白染色结果；b：Tau蛋白阳性区域占海马体齿状回部位的面积 (TE2:APOE2敲入小鼠, TE3: APOE3敲入小鼠, TE4: APOE4敲入小鼠, TEKO: ApoE敲除小鼠)[4]

随着测序技术的发展，全基因组关联分析（Genome-wide Association Study，GWAS）已广泛应用于复杂疾病的遗传因素分析（图4），可以更高效地获得疾病与SNP之间的相关性。GWAS利用高通量测序技术，分析数以万计的SNPs以及这些SNPs与临床表型和可测性状的相关性，从而全面地揭示出不同复杂性状的遗传机制。目前，全世界范围内已开展了4000多项GWAS研究，发现了超过10万个与各种疾病（如癌症，高血压，II型糖尿病，类风湿性关节炎等）以及重要生理性状关联的基因位点。

图4 GWAS分析人群中等位基因的变异频率（https://www.ebi.ac.uk/）

完成了GWAS分析之后，我们还需要借助下游工具对GWAS的分析结果进一步注释和挖掘，筛选可能致病的SNP位点。相关的注释网站和数据库很多，以下推荐2个网站，供大家参考。GWAS4D是通过组织/细胞类型特异性和非编码调控变异的优先排序，来预测特定复杂疾病和性状的潜在致病机制。我们将GWAS summary数据导入，便可以输出SNP位点的优先排序、SNP位点在基因组区域的可视化以及SNP功能预测和注释等结果（图7）。网址：http://mulinlab.tmu.edu.cn/gwas4d 。

图5 GWAS4D可进行分析的界面

图6 SNPedia首页

受益于二代测序及GWAS的联合应用，研究人员发现了众多和临床表型具有一定联系的SNP位点，然而要验证这些位点与临床表现的关系，必须回到体内进行研究。如果这些突变可以在小鼠体内找到，那么突变小鼠就能为临床研究提供宝贵的信息。因此构建突变小鼠，是有效验证临床检测结果的关键一步。

构建突变小鼠时，首先需要确定的是突变位点的人鼠同源性及保守性。小鼠是解析人类基因功能、研究人类疾病重要的模式生物。99%的人类基因都可以在其基因组中能找到相应的基因。但需要注意的是，人鼠编码基因序列相似性平均为85%，而非编码基因的相似度只有50%[5]，因此找到同源基因还需要判断突变位点的序列保守性。

这里举一个例子，PLD3的一个SNP（rs145999145）是迟发性阿尔兹海默症的危险因素之一。我们在NCBI-SNP数据库可搜索到该SNP的位点信息，如下：

图7 rs145999145在NCBI数据库中的信息页

可见红色框中提供了突变位点的序列信息，而绿色框中提示了突变类型是错义突变（图7）。根据该位点附近的侧翼序列以及给到的基因组位点，我们可以找到其在人源PLD3基因上的位置，转录本NM_012268.4，c.694 G>A，也即p.232V>M，位于exon9。通过对人鼠同源基因的同源性分析（图8），可以很快找到相应小鼠的突变位点：NM_001317355.1，c.688 G>A，p.230V>M，位于exon10。

图8 人鼠PLD3蛋白同源性对比结果

确定了小鼠的突变位点后，我们便可以针对该突变位点设计Guide RNA，利用Crispr/Cas9技术来构建点突变小鼠（图9）。

图9 PLD3-V230M突变小鼠构建策略

接下来和大家分享一个案例来具体说明如何利用基因修饰小鼠验证SNP的临床表型。

【标题】自身免疫疾病相关IgG1变体调控B淋巴细胞活化和分化的新机制

【期刊】Science (IF=41)

系统性红斑狼疮SLE是最常见的自身免疫疾病之一，是一种由遗传、环境、免疫等多种因素导致的复杂性疾病。其发病机制至今尚不清楚，导致治疗手段有限且无法根治。人体中广泛存在具有自身反应性的IgG型记忆性B细胞，SLE等自身免疫疾病常伴随大量自身抗体的产生。

研究人员猜想IgG型B细胞受体（IgG-BCR）的异常活化可能参与到SLE的发病过程。通过对患者进行基因检测，研究人员发现，IgG1重链基因IGHG1上的SNP（rs117518546）在SLE患者中显著增加，该SNP导致IgG1第396位甘氨酸突变为精氨酸（IgG1-G396R）（图9）。携带该SNP的SLE患者产生更多更广泛的IgG1型的自身抗体，发生炎症反应的风险增加，疾病活动指数也更高，揭示该SNP为新的SLE易感基因位点。

图10 rs117518546突变位点（图A）及在不同地区人群中的比例（图B）

值得注意的是，该SNP在东亚人群中的出现的频率远高于欧美人群（图10），这提示该SNP是以汉族为代表的东亚人群特有的SLE易感基因位点，可能是我国SLE患者与其他人群患者的临床表现和治疗反应存在差异的因素之一。

通过同源性对比，研究者发现该SNP在小鼠上的位点为390位甘氨酸突变为精氨酸，因此构建了IgG1-G390R突变小鼠（图11）。通过诱导野生型小鼠和突变小鼠发生自身免疫疾病，研究者发现携带该SNP的小鼠产生更多、更广泛的自身抗体，而这依赖于B细胞受抗原刺激后大量自身反应性浆细胞的分化（图12）。这一结果验证了在SLE患者中的发现，并从B细胞命运决定层面给出了初步解释[6]。

图11 构建IgG1-G390R敲入小鼠

图12诱导自身免疫病发生后，野生型小鼠和G390R小鼠体内dsDNA和SmD抗体动态变化。

该研究从疾病易感基因位点的临床遗传学研究出发，经过基于基因修饰小鼠的动物模型研究，将临床上发现的问题在真实的体内实验中验证，确认了IgG1-G396R在SLE疾病发生发展中的作用。这项研究为SLE研究提供了全新的研究靶点，也为复杂疾病相关易感基因位点的研究提供了创新性的研究模式，最终发表在《Science》杂志上。

南模生物深耕基因修饰动物模型行业二十余年，在构建类人SNP同源突变小鼠方面具有丰富的经验，助力客户发表在《Cell Research》、《Immunity》等多种高水平杂志上，受到广泛认可。欢迎大家咨询，快来定制专属您的点突变小鼠吧。

参考文献：

[1]杨焕明. 人类基因组计划及其意义——规模化、序列化、信息化与产业化、医学化、人文化[J]. 科技与法律, 2000(3):2.

[2] Altshuler D, Pollara VJ, Cowles CR. An SNP map of the human genome generated by reduced representation shotgun sequencing. Nature. 2000 Sep 28;407(6803):513-6.

[3] https://www.snpedia.com/index.php/APOE-%CE%B54

[4] Shi Y, Yamada K, Liddelow SA, et al. ApoE4 markedly exacerbates tau-mediated neurodegeneration in a mouse model of tauopathy. Nature. 2017 Sep 28;549(7673):523-527. doi: 10.1038/nature24016

[5] https://www.nih.gov/news-events/news-releases/new-comprehensive-view-mouse-genome-finds-many-similarities-striking-differences-human-genome

[6] Chen X, Sun X, Yang W, et al. An autoimmune disease variant of IgG1 modulates B cell activation and differentiation. Science. 2018 Nov 9;362(6415):700-705. doi: 10.1126/science.aap9310.