南模生物自主研发了TNF受体超家族各类相关基因的敲除和人源化敲入小鼠模型，助力靶向TNF受体的药物研发、药物功效和安全性检测研究。

肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFRSF)(以下简称TNF受体超家族)是一类可以通过半胱氨酸富集区域(cysteine-rich domains, CRDs)与肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factors superfamily, TNFSF)(以下简称TNF超家族)结合的细胞因子受体超家族。目前已发现的TNF超家族蛋白有19种，TNF受体超家族蛋白有29种，广泛表达在哺乳动物各种组织中[1]。TNF与TNF受体结合后激活相关信号通路调控细胞增殖、细胞存活和细胞分化，促进免疫反应，有些结合还可以触发细胞凋亡和其他形式的细胞死亡。

根据TNF与TNF受体结合（图1）后是否可以诱导细胞凋亡，TNF受体超家族可分为死亡受体和非死亡受体两类。下面将分别介绍两类受体的典型分子，希望帮助大家对TNF受体超家族有更进一步的认识。

图1 TNF超家族与TNF受体超家族（图片引自知乎）

肿瘤坏死因子受体 10B ( tumor necrosis factor receptor superfamily 10B, TNFRSF10B) ，又名TNFR10B，也称为死亡受体5 ( death receptor 5，DR5)。DR5的胞外结构域可通过与促凋亡配体Apo2L/TRAIL结合，激活细胞凋亡通路，DR5胞内的死亡结构域则促使DR5聚集，从而快速传递、放大细胞凋亡信号。DR5表达于多种癌症细胞，肿瘤内皮细胞，而在正常组织和细胞中表达量相对较低，DR5的配体TRAIL和激动型单克隆抗体因此成为理想的广谱抗肿瘤蛋白药物[2]。此前，Yagolovich 等人制备了DR5蛋白的突变体——DR5-B，能够比目前的TRAIL更快更有效地杀死多种肿瘤细胞，包括结肠癌细胞、人T淋巴细胞和白血病细胞[3]。创胜集团旗下奕安济世目前获得经 InhibRx 授权的第三代死亡受体 5 (DR5) 激动剂抗体，已由NMPA批准进入 中国1期临床实验，预判在应对目前尚无有效药物治疗的消化道肿瘤和间皮瘤等多种肿瘤方面可以作为有效的单药疗法。

TNF受体超家族11B ( tumor necrosis factor receptor superfamily 11B, TNFRSF11B )，又名TNFR11B，也称为护骨素( osteoprotegerin, OPG) 、破骨细胞形成抑制因子(OCIF)， 主要在成骨细胞中表达[4]。临床研究表明OPG基因的多态性和骨密度相关。老年人多容易出现骨密度和骨质量的下降的现象，这造成了骨微结构的破坏，增加了骨脆性，从而容易发生骨折，这样的全身性骨病即是骨质疏松症 (osteoporosis)。OPG全身敲除的小鼠，具有典型的骨质疏松症和动脉钙化的表型（简称“骨质疏松小鼠”），可以为“人类骨质疏松症”治疗药物的筛选和评价、骨质疏松基因治疗、破骨细胞和成骨细胞的相互作用机制等研究提供理想的动物模型和新型研究手段，具有重要的理论意义和应用价值[5]。

肿瘤坏死因子受体2 (Tumor necrosis factor receptor superfamily 2, TNFRSF2)，也叫TNFR2，CD120b或者p75。TNFR2的表达仅限于抑制性免疫细胞，尤其是调节性T细胞 (Tregs)和髓系抑制性细胞 (MDSCs)。此外，TNFR2也在肿瘤细胞中表达[6]。TNFR2主要起到免疫抑制作用，因此具有高免疫抑制力的TNFR2⁺ Tregs细胞会被招募到肿瘤微环境中，从而促进肿瘤免疫逃逸。TNFR2基因敲除小鼠对肿瘤表现出增强的免疫应答，肿瘤生长放缓。这可能是由于缺乏TNFR2⁺ Treg，或未能发展出全身性自身免疫，或MDSC数量减少和功能受损[7]。因此，利用TNFR2拮抗剂抑制Tregs，恢复肿瘤免疫应答并消除肿瘤，成为了肿瘤免疫治疗的新策略。

肿瘤坏死因子受体4 (tumor necrosis factor receptor superfamily 4, TNFRSF4)，又名TNFR4，也称为OX40，是I型跨膜蛋白质，主要表达于活化的CD4⁺、CD8⁺ 和调节性T细胞中[8-9]。OX40-OX40L（图2）信号可以阻断Tregs抑制T细胞以及减少Tregs生成的能力，也可通过抑制Tregs的免疫抑制效应并限制其种群，进一步扩大T细胞活化效应[9]。抗OX-40的应用增加了外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞的增殖，增加了召回幼稚T细胞的反应，并增加了内源性肿瘤特异性免疫反应。

目前，OX40已成为新药研发领域的热门靶点之一，全球已经有十余款OX40抗体迈入临床阶段，包括信达生物、辉瑞、阿斯利康、百时美施贵宝等公司均有涉足这一领域，研究进展较快的已经进入2期临床。

图2 OX40-OX40L complex

肿瘤坏死因子受体5 ( tumor necrosis factor receptor superfamily 5, TNFRSF5) ，又名TNFR5，也称为CD40，是I型跨膜蛋白质，主要在成熟和激活的 B 细胞中表达，同时也在抗原呈递细胞中表达。CD40-CD40L结合后，招募TNFR相关因子促进细胞内信号传导，参与机体的体液免疫和细胞免疫反应[10-11]。例如，CD4+ T细胞通过CD40L-CD40结合激活树突细胞 (dendritic cell, DC)，激活后的DC可促进T细胞分化，引发有效的CTL (cytotoxic T cell, CTL)反应。CD4⁺辅助T细胞则在获得DC呈递的pMHC-I，变成CD4⁺ Th-APC，导致CD4⁺ T-CD8⁺ T细胞通过CD40L-CD40直接相互作用，刺激CD8⁺ CTL的增殖和记忆形成。在CD40靶点的药物开发上，罗氏、艾伯维、Apexigena、Celldex和Alligator Biosciences均有涉足，目前处于领先的是Apexigen的APX005，处于II期临床阶段，而Alligator的Mitazalimab产品在不同的癌症治疗的临床试验中也有比较积极的反馈。

总之，TNF超家族-TNF受体超家族参与了多种人类疾病的发生发展，如骨质疏松症、免疫系统疾病和肿瘤等[1]，并且靶向TNF受体超家族的治疗疾病的方法已被广泛报道。在肿瘤临床治疗领域，通过调控TNFR2、CD27、CD40、OX40、BCMA、4-1BB等TNF受体超家族成员发挥抗癌作用，已成为免疫疗法的新高地。目前，针对以上靶点的药物研发正在如火如荼地进行，但是暂时还没有药物上市，这一领域仍大有可为。

南模为助力TNF受体超家族研究以及肿瘤药物研发，自主研发了一系列的TNF受体超家族小鼠模型，以下是详细品系列表。

表1 南模生物肿瘤坏死因子受体超家族模型资源库

模型一：Tnfrsf11b（Opg）基因敲除小鼠模型的验证

X-Ray检测Opg基因纯合缺失小鼠的骨密度变化，与野生型小鼠相比，Opg^-/-小鼠的股骨发生骨质疏松(图3a,b)。HE染色结果显示，与野生型小鼠相比，Opg敲除小鼠在主动脉出现动脉钙化，其特点是没有动脉粥样斑块形成，只是出现动脉中膜钙化（图3c, d）。

图3 Opg^-/-小鼠表现出骨质疏松和主动脉钙化

TRAP染色检测股骨皮质轴的TRAP阳性的破骨细胞，与野生型小鼠相比，Opg^-/-小鼠的股骨含有较多的破骨细胞，具有更快的骨质代谢速度（图4a，b）。HE染色检测破骨细胞形态，与野生型小鼠相比，骨表面的破骨细胞呈现出更明显的立方形（图4c，d）。

图4 Opg^-/-高速骨质更新

模型二：OX40人源化小鼠模型（OX40-HU）的验证

2020年2月，信达生物关于IBI101研发的文章发表在Cancer Immunology, Immunotherapy期刊上，文章题目为“Development and characterization of a novel anti-OX40 antibody for potent immune activation”。

该项研究中的OX40小鼠是由南模生物提供。靶向OX40的抗体药物或联合用药后，具有良好的抑制肿瘤生长、提高肿瘤浸润淋巴细胞比例和细胞因子释放淋巴细胞比例的作用（图5）。

图5 OX40人源化小鼠MC38 荷瘤模型体内抗肿瘤药效验证及CD8⁺ T细胞应答情况。

注：a 显示的是OX40阳性抗体药物IBI101单药或联合用药后的肿瘤生长曲线。箭头所示为给药节点。b显示的是在实验过程中小鼠体重情况。c和d显示的是分别给小鼠用药后，收集肿瘤(c)和脾脏(d)并通过流式细胞术分析各类淋巴细胞的比例。e和f显示的是流式检测肿瘤(e)和脾脏(f)(n≥5)T细胞针对肿瘤释放相应细胞因子的比例。

模型三：CD40人源化小鼠模型（CD40-HU）的验证

CD40 人源化纯合子小鼠和野生型小鼠外周血细胞FACS 检测，结果显示CD40人源化纯合子小鼠CD19 阳性细胞中可以检测到人源CD40 的活跃表达，其表达量与野生型小鼠鼠源Cd40 的表达类似（图6）。

图6 FACs检测CD40 人源化小鼠外周血细胞CD40 表达。

CD40 人源化小鼠接种MC38 结肠癌细胞系，肿瘤生长至约100 mm3随机将动物随机分组（n=8）给药。结果显示针对人的CD40 阳性药物有非常显著的抗肿瘤效果（p<0.001）；针对PD-1 和CD40 的抗体药物联合用药有更明显的抗肿瘤效果（图7）。

图7 CD40 人源化小鼠MC38 荷瘤模型体内抗肿瘤药效验证

查看TNFR2，CD27,  GITR,  4-1BB等更多家族受体基因敲除或人源化小鼠的验证数据请点击下方链接。