2024年9月25日，上海科技大学张辉、同济大学唐娟、复旦大学刘琛共同通讯在Circulation（IF=35.5）杂志上在线发表了题为“Activation of Imprinted Gene PW1 Promotes Cardiac Fibrosis After Ischemic Injury”的研究论文。该研究表明印迹基因PW1的激活促进缺血性损伤后心脏纤维化。

印记基因是一类特殊的基因，它们仅表达来自父母一方的等位基因，而另一方的等位基因则不表达。这种表达模式的调控机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及长链非编码RNA的作用等。近年来的研究表明，印记基因在多种生物学过程中发挥着重要作用，尤其是在胚胎心脏发育和先天性心脏病的发生中扮演着关键角色。尽管如此，关于印记基因是否参与成年心脏损伤后的再生和修复过程，目前的研究还相对较少。

心脏纤维化以心肌细胞外基质（ECM）沉积过多为特征，是心脏病治疗的重要目标。PW1（父系表达基因3）是一个由父系等位基因表达的印迹基因，从头嘌呤生物合成（DNPB）是核苷酸合成的重要途径。然而，PW1和DNPB在心肌缺血时心肌成纤维细胞产生ECM中的作用尚不清楚。

为评估Pw1的父本和母本等位基因的表达情况，作者构建了Pw1^{CreER-2A-eGFP}（Pw1^CreER）小鼠。并通过将雄性杂合子Pw1^CreER/+小鼠与雌性Rosa26-loxp-stop-loxp-tdTomato（R26-tdTomato）报告小鼠交配获得Pw1^pCreER/m+;R26-tdTomato小鼠。雌性杂合子Pw1^CreER/+小鼠与雄性R26-tdTomato报告小鼠杂交获得Pw1^p+/mCreER;R26-tdTomato小鼠。结果表明，在Pw1^pCreER/m+; R26-tdTomato小鼠的肠道、骨骼肌、胃、肺和心脏中观察到强的tdTomato信号，并且发现在心房中tdTomato表达水平高，而心室中表达水平较低。相比之下，在Pw1^p+/mCreER;R26-tdTomato小鼠的器官中未检测到tdTomato信号。以上结果提示，Pw1只有父本等位基因在正常成年小鼠心脏中是活跃的。

Fig1. Pw1父本等位基因在正常成年小鼠心脏中活跃。

接下来，作者探究了在通过结扎左前降支（LAD）冠状动脉诱导的心肌梗死（myocardial 

Infarction，MI）心脏中Pw1等位基因的表达。结果表明，与假手术心脏的心室相比，梗死区域出现了大量eGFP+细胞，表明父本Pw1等位基因在损伤部位被激活。免疫染色显示eGFP主要在梗死区域的PDGFRa+成纤维细胞中表达。接下来，作者检测了Pw1^p+/mCreER小鼠MI后的母本等位基因Pw1。结果显示，母本Pw1等位基因也在梗死区域的PDGFRa+成纤维细胞中被激活。这些结果表明，在MI后梗死区域两个Pw1等位基因都被激活。此外，qPCR结果显示，梗死区域父系和母系两个Pw1等位基因的mRNA水平均显著高于远端区域。

鉴于Pw1在损伤区域的表达上调，作者接下来探究了Pw1在MI后心脏修复中的功能。首先，作者评估了Pw1^p+/m+（野生型）、Pw1^p+/mCreER（母本失活）、Pw1^pCreER/m+（父本失活）和Pw1^{pCreER/mCreER}（Pw1 KO）小鼠在损伤前和损伤后的心脏功能。结果表明，与对照组相比，MI后28天，Pw1^pCreER/m+和Pw1 KO小鼠心脏功能（射血分数、缩短分数、收缩末期容积、舒张末期容积、左心室收缩末期维度和舒张末期维度）有所改善；而在Pw1^p+/mCreER小鼠中未观察到改善现象。以上结果表明父本等位基因在MI后心脏功能中的具有主要作用。

随后对心脏进行天狼星红染色分析。结果表明，与WT对照相比，Pw1^pCreER/m+和Pw1 KO小鼠的替代和间质纤维化区域更小，而血管周围纤维化区域没有显著差异。对左心室中几种ECM基因的表达水平进行分析，结果显示，Col1a1、Col1a2、Col3a1、Col4a1、Col6a1和Fn1的表达水平在Pw1 KO小鼠中下调；编码肌成纤维细胞标记物Acta2在Pw1 KO组中也较低。且Pw1 KO小鼠损伤的左心室中FN1蛋白表达水平降低。这些结果提示，Pw1缺失可增强心肌梗死后的心脏功能，降低心肌纤维化程度。

PDGFRa是成年小鼠心脏中成纤维细胞的标志物。作者将Pw1^fl/fl与Pdgfra-Cre小鼠交配，获得了成纤维细胞特异性敲除Pw1（Pdgfra-Cre;Pw1^fl/fl）的小鼠。与对照组相比，MI后Pw1 CKO小鼠的射血分数、缩短分数、收缩末期容积和舒张末期容积相较于对照组有所改善，替代性和间质性纤维化区域更小。Pw1 CKO小鼠损伤心脏组织中ECM基因、Acta2基因的mRNA水平及FN1蛋白表达水平均显著降低。以上结果表明Pw1在PDGFRa+细胞中的缺失改善了小鼠MI后的心脏功能并减少了纤维化。

接下来作者探究了Pw1对成纤维细胞ECM基因调节作用。通过RNA-seq富集到了细胞组分ECM中富集182个DEGs（Pw1 CKO组下调135个，上调47个），表明成纤维细胞中大多数ECM DEGs表达水平因Pw1缺失而降低。通过RNA-seq分析，找到了在Pw1 CKO成纤维细胞中找到了10640个差异表达基因（DEGs），其中5329个上调，5311个下调。进一步GO分析结果表明，在ECM中富集了182个DEGs(与对照组相比，Pw1 CKO组中135个下调，47个上调）。以上结果表明，Pw1的缺失抑制了MI后心脏成纤维细胞中许多ECM基因的表达。

作者接着探究了Pw1的靶基因。通过一系列的高通量测序及实验验证，结果表明，Pfas（编码DNPB酶PFAS）是损伤后心脏中PW1的直接靶标。

为进一步证明Pfas是否是Pw1在成纤维细胞中调节ECM基因所必需的，作者将Pdgfra-CreER小鼠（由南模生物提供）与Pfas^fl/fl交配获得了Pfas CKO（PDGFRa-CreER;Pfas^fl/fl）及对照（PDGFRa-CreER;Pfas^fl/+）小鼠。qPCR结果表明，Pfas CKO成纤维细胞中Pfas显著缺失，同时几个ECM基因减少。上述结果提示Pw1通过在损伤后心肌成纤维细胞中调节Pfas来调控ECM基因表达。

由于Pfas编码DNPB途径中的酶PFAS，作者假设PW1可能调节心脏成纤维细胞中的嘌呤合成，接下来对此进行了验证。作者对过表达Pw1和野生型的心脏成纤维细胞进行代谢组学分析，结果发现，在Pw1过表达组中，参与嘌呤代谢途径的代谢物，包括IMP、AMP、肌苷和腺嘌呤表达上调，而在嘧啶代谢途径中，仅有尿嘧啶表达上调。此外过表达Pw1的活化成纤维细胞中的AMP浓度显著升高。这些结果表明，PW1增强了激活的心脏成纤维细胞中的嘌呤合成。

Fig6. PW1促进活化的心脏成纤维细胞中嘌呤的生物合成。

Pfas对于Pw1介导的ECM产生至关重要，并且其过表达增加了激活的心脏成纤维细胞中ECM基因和Acta2的表达。因此，作者假设DNPB途径可能对于这些细胞中ECM的产生至关重要。为验证这一假设，作者利用两种DNPB抑制剂处理细胞（6-巯基嘌呤和LSN3213128）。结果表明，几个ECM基因的表达水平降低，即DNPB途径对于激活的成纤维细胞中ECM基因的表达是必需的。

最后，作者评估了Pfas在体内成纤维细胞中的作用。作者在Pfas CKO小鼠中通过通过永久结扎左前降支（LAD）冠状动脉诱导MI。心肌梗死后28天的超声心动图评估显示Pfas CKO小鼠的心功能指标得到了改善，且替代区和间质纤维化区都较小。

与前述一致，作者进行了RNA-seq分析，结果表明Pfas的缺失显著影响了心肌梗死后心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达水平。

Fig7. 成纤维细胞中Pfas的失活可改善心肌梗死后的心脏功能并限制心肌纤维化.