斑马鱼不仅具有体积小，产卵量高，发育成熟时间短，饲养条件简单，易于培养等特点，她富有通透性的体表更让我们可以轻松地在显微镜下观察到各器官组织。

更厉害的是，如果能够通过基因操作手段，将荧光蛋白导入到斑马鱼体内，在特定的组织器官中表达，就可以轻松实现在荧光显微镜下观察到特定器官的发育与生理变化，甚至可以动态追踪其胚胎发育全程以及外源性物质或基因突变对器官发育的影响。

Super star——抗肿瘤药物靶点筛选利器——血管特异性荧光转基因斑马鱼

血管特异性转基因荧光斑马鱼能实现体内脉管系统的高分辨率成像，并可以对血管生长和重塑进行长期的跟踪、重复成像，同时体内血管仍持续正常发育。下图中列举了部分血管或血液荧光转基因斑马鱼品系。

Fig1. Zebrafish transgenic lines for time-lapse vascular imaging.（图片来自The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology）

其中最为常用的当属fli1a:EGFP和kdrl:EGFP这两种了。fli1a:EGFP转基因斑马鱼中绿色荧光标记血管和淋巴管，而kdrl:EGFP品系仅标记血管内皮细胞。fli1a:EGFP转基因斑马鱼在血管生成、淋巴管生成、肿瘤形成、抗肿瘤药物筛选与评价等领域都得到了广泛的应用。

Fig2. EGFP expression in the vasculature of live TG(fli1:EGFP) larvae and adults. 【图片来自Developmental Biology 248, 307–318 (2002)】

血管生成机制或相关基因功能研究

利用fli1a:EGFP转基因斑马鱼作为模型，应用到血管生成机制研究或血管生成相关基因功能研究中时，我们既可以通过正向遗传学方法，即对斑马鱼基因序列进行大规模的随机诱导突变，根据所获得的突变表型而探寻发生突变的基因；也可以通过反向遗传学方法，即对斑马鱼血管形成基因及相关调控基因等已知的基因片段进行沉默或过表达，由此产生表型，确定基因功能。

例如：对某特定基因进行Morpholino knockdown可抑制斑马鱼血管生成，说明该基因在血管形成过程中发挥重要作用。

Fig3. GeneX  knock down inhibits the trunk angiogenesis in zebrafish. (A-D) Representative fluorescent images of zebrafish embryos at 32h post-fertilization (hpf). (C-E) Compared with wild-type control, embryos injected with geneX-MO present a lower number of incomplete ISVs and only occasional sprouts (asterisk) of dorsal aorta. The boxed regions are shown at higher magnification in the right panels. DLAV, dorsal longitudinal anastomotic vessels; ISV, intersegmental vessels; DA, dorsal aorta; PCV, posterior cardinal vein.  

对bmp10基因进行过表达可抑制斑马鱼血管生成，说明该基因具有抑制血管形成过的作用。

Fig4. Nonmutant bmp10 overexpression inhibits the trunk angiogenesis in zebrafish.  (A-F) Representative bright field and fluorescent images of zebrafish embryos at 32h post-fertilization (hpf). Red arrow indicates haemorrhage in the tail (B). (C-H) Compared with wild-type control, nonmutant zebrafish bmp10 mRNA (200pg) injection present a lower number of incomplete ISVs and only occasional sprouts (asterisk) of dorsal aorta. The red boxed regions are shown at higher magnification in the right panels. DLAV, dorsal longitudinal anastomotic vessels; ISV, intersegmental vessels; DA, dorsal aorta; PCV, posterior cardinal vein. 

抗肿瘤或抗血管生成药物筛选与评价

血管生成(angiogenesis)是癌症治疗的关键靶点。传统用于抗血管药物高通量筛选的方法主要有体外细胞模型，但是这种方法筛选出的结果和体内实验相关性较差，而体内模型主要有小鼠角膜袋（Corneal Micropocket Assay）和鸡胚尿囊膜（Chick Chorioallantoic Membrane Assay），但这两种方法操作难度大，费时，耗力，成本高，实验周期长，而且筛选药物的通量很低，大量的研究证实，斑马鱼是目前最理想的血管生物学研究以及抗肿瘤血管生成药物评价模型。利用血管特异性EGFP转基因斑马鱼可以成功实现在96孔板或者384孔板中进行抗血管新药或者新药靶点的体内高通量和高内涵筛选。

Fig5. Screening and evaluation of anti-tumor or anti-angiogenic drugs.

例如：

贝伐单抗/Bevacizumab（商品名-阿瓦斯汀/Awastin），2017年销售额71.41亿美元），由罗氏/基因泰克公司最先研发成功，2004年2月26日获得美国FDA批准上市，是全球第一支治疗型抗血管生成单克隆抗体药物，一线治疗结直肠癌。

贝伐单抗至今缺乏体内抗血管生成的药效学数据。

南模生物斑马鱼技术服务平台，首次利用斑马鱼血管模型全面快速评估了贝伐单抗-Bevacizumab的抗血管功效：贝伐单抗能够有效抑制斑马鱼肠下血管（SIV）和视网膜血管的生长，为临床试验提供了新的可靠依据。南模生物斑马鱼平台与瑞金医院呼吸科高蓓莉课题组合作的这一成果，在线发表于2018年8月份的国际知名药物研发期刊-《Drug Des Devel Ther. 》

Fig6. Bevacizumab impairs formation of zebrafish SIV in a dose-dependent manner. Notes: Representative fluorescent images of control or embryos treated with bevacizumab at 3 dpf. In control embryos, SIVs developed as a smooth basket-like structure over the yolk at 3 dpf (A, yellow dashed lines). In contrast, embryos treated with bevacizumab resulted in specific defects in SIVs formation (B, C, white dashed lines). (D, E) Quantification of the area and number of SIV show significant decrease in bevacizumab-treated embryos. Error bars, SEM; *P0.0001 (n=10; ANOVA).

Fig7. Bevacizumab causes specific vasculature formation defects in the SIV. Notes: (A–D) Representative fluorescent images of zebrafish embryos at 3 dpf treated with PBS (control) or bevacizumab (2 mg/mL). (A, B) In contrast, treatment with bevacizumab at the pectoral fin stage (2.5 dpf) causes specific vasculature formation defects in the SIV (B, white arrow). (C–D) Truncal vasculature of the zebrafish shows no appreciable phenotypic differences relative to control.

如何构建组织特异性荧光转基因斑马鱼？

除了血管特异性荧光斑马鱼以外，还能有标记其它器官吗？比如心脏啦、肝脏啦、淋巴细胞啦？

当然可以！只要借助斑马鱼转基因技术，就可以实现稳定的蛋白表达或是特定组织中目标蛋白的可调控表达。最常用的斑马鱼转基因系统是来源于青鳉的Tol2转座子体系。

将带有转座子的供体质粒与编码转座酶的mRNA一起通过显微注射注入到单细胞阶段斑马鱼胚胎中，转座酶催化Tol2转座子通过”剪切-粘贴“的方式进行转座，将转座子载体中的目的片段（组织特意性启动子-荧光蛋白）整合到斑马鱼基因组中。注射过的胚胎经培养后再从成鱼中筛选出在生殖细胞系中有插入片段并能传递到下一代的转基因斑马鱼。

Fig8. Schematic diagram of establishing a specific promoter driven EGFP transgenic zebrafish model.

例如：

肝脏特异性EGFP绿色荧光转基因斑马鱼模型Tg(fabp10a:EGFP)：

Fig9. Tg(fabp10a:EGFP) transgenic zebrafish model generated by SMOC.

巨噬细胞标记EGFP绿色荧光转基因斑马鱼模型Tg(zlyz:EGFP)：

Fig10. Tg(zlyz:EGFP) transgenic zebrafish model generated by SMOC.