1月15日，国际知名学术期刊《Immunity》在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所陈剑峰研究团队的最新研究成果“Fever Promotes T Lymphocyte Trafficking via a Thermal Sensory Pathway Involving Heat Shock Protein 90 and α4 Integrins”。该工作揭示了发热促进免疫细胞迁移的分子机制，以及该机制在机体免疫调控中的重要功能。

南模生物为该研究构建了Itga4点突变小鼠模型。

• α4整合素

在炎症与癌症的病理过程中, 淋巴细胞与癌细胞的运动是其中的关键步骤。而决定这些细胞运动的一类重要分子是细胞黏附分子(cell adhesion molecule, CAM), 其中, 整合素(integrin)家族是最重要的一类黏附分子。整合素是一种跨膜的异质二聚体，作为跨膜接头在细胞外基质之间起着双向联络作用和细胞粘着作用，参与的信号转导，对细胞的许多行为产生影响。在细胞运动的过程中, 整合素的功能受到动态的、精确的调控。而病理条件下的整合素功能会发生紊乱。

α4整合素主要包含两种分子, 分别是α4β1（又称VLA-4，由 Itga4 基因编码）和α4β7。其中, 整合素α4β1主要结合配体为血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1), 主要表达在炎症部位HEVs样的血管内皮表面, 并且受细胞因子诱导表达; 而整合素α4β7主要结合配体为PP结(Peyer’s patches, PP)和肠系膜淋巴结等HEVs上表达的黏膜地址素细胞黏附分子-1(mucosal addressin cell adhesion molecule-1, MAdCAM-1)。

α4整合素可以同时介导淋巴细胞的滚动黏附和稳定黏附, 使它在机体免疫稳态维持中处于非常重要的位置。淋巴细胞在血管内皮细胞上的稳定黏附是其跨内皮细胞迁移的先决条件, 所以类似于整合素LFA-1, α4整合素同样能够介导淋巴细胞在HEVs上跨内皮细胞迁移。

• 热休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）

热休克蛋白是细胞在应激条件下产生的一类蛋白, 几乎在所有生物中广泛表达。研究发现, 发热所产生的高温胁迫可以激活热休克反应, 不但可以诱导宿主细胞内起保护作用的热休克蛋白表达, 同时也可以诱导病原体内热休克蛋白激活宿主免疫防御。

• 发热促进α4整合素介导的T细胞粘附和迁移

图1. 热应激对整合素介导的T细胞粘附和迁移的影响。野生型小鼠脾脏T细胞在体外分别用正常体温（37℃）和发热温度（40℃）在含有或不含100ng/mL PTX的培养基中预处理12小时。PS/2为a4-blocking antibody；DATK32为a4b7-blocking antibody；2E6为b2-blocking-antibody。图B-C可见发热温度（40℃）特异性促进了α4整合素介导的T细胞粘附和迁移。

• Hsp90与α4尾部结合并通过 inside-out 信号激活α4整合素

发热温度（40℃）处理的T细胞中Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和Hsp10表达上调，免疫共沉淀结果显示Hsp90AA1和Hsp90AB1（Hsp90的两种同种型）选择性结合α4。在T细胞中过表达Hsp90，Hsp90-α4结合显著增强；促进了α4整合素介导的T细胞与VCAM-1和MAdCAM-1底物的粘附和迁移。

图2. 热应激上调Hsp90的表达并促进其与T细胞中α4整合素的结合。

Hsp90与α4之间究竟是通过哪些结构域或关键位点相互结合的呢？利用不同亚基整合素尾部模型蛋白和Hsp90不同结构域与HA-tag的融合表达，发现Hsp90的N-末端结构域（NTD）和C-末端结构域（CTD）都直接并仅与α4亚基结合。进一步确定Hsp90与α4尾部的ENRRDSWSY基序结合。将ENRRDSWSY基序中的9个残基中的每一个单独突变为丙氨酸，结果发现 R985A、W989A和Y991A 这三个突变消除了Hsp90与α4细胞质尾部的结合，表明R985，W989和Y991是Hsp90与α4整合素结合的关键位点。

图3.  Hsp90通过α4细胞质结构域中的短序列与α4整合素结合。

图4. Hsp90的N和C末端与α4亚基结合。

利用α4整合素基因Itga4^R985A/R985A点突变小鼠模型（南模生物构建），消除体内Hsp90-α4的相互作用，也导致T细胞不能粘附和迁移，表明Hsp90-α4结合对于发热诱导的α4整合素介导的T细胞粘附和迁移是必需的。此外，点突变小鼠中Hsp90-α4整合素相互作用受阻，也导致热应激状态下无法促进T细胞黏附以及归巢。说明Hsp90-α4整合素相互作用对于高内皮小静脉(high endothelial venules, HEVs)中热应激促进的T细胞滞留以及淋巴结归巢都是必需的。

图5.  Hsp90-α4整合素结合对热应激诱导的T细胞粘附和迁移至关重要。

发热状态或过表达Hsp90都会导致VCAM-1和MAdCAM-1与野生型T细胞的结合增加，但对Itga4R985A/R985A点突变的T细胞没有作用。表明由热应激增强的α4整合素结合依赖于Hsp90-α4相互作用。通过FRET分析α4胞外延伸域相对于质膜的方向，发现发热或过表达Hsp90后，野生型T细胞中的FRET效率降低，而Itga4R985A/R985A点突变T细胞不受影响。表明热应激诱导的α4的延伸依赖于Hsp90-α4相互作用。免疫共沉淀结果还发现，Hsp90与α4的结合是通过增强talin和kindlin-3这两种关键整合素共激活因子的结合来触发α4整联蛋白 inside-out 激活的。

图6.  Hsp90与α4的结合诱导α4整合素的活化。

• Hsp90触发α4整合素的二聚化和聚类以激活FAK-RhoA

通过将绿色荧光蛋白（GFP）的两个互补部分，GFP S1-10和GFP S11，融合到α4的C末端，建立了双分子荧光互补（BiFC）系统。如果α4以二聚化的形式与Hsp90结合，那么就可以诱导出功能性GFP的表达。结果表明，每个Hsp90分子都同时与两个α4整合素分子结合这使整合素更接近，在T细胞的外膜上形成它们的簇。并且发热状态下野生型T细胞膜上的GFP信号增强，说明发热能有效诱导α4二聚化。Itga4R985A/R985A点突变的T细胞在发热状态下不能诱导GFP的表达，因此说明α4二聚化依赖于Hsp90-α4相互结合。

图7. Hsp90与α4的结合诱导细胞膜上α4整合素的二聚化和聚集。

利用Hsp90不同结构域组合的突变蛋白过表达，发现缺失NTD或CTD都无法诱导α4整合素的二聚化，说明这两个结构域都是α4整合素二聚化所必需的。

图8. Hsp90的NTD和CTD都是诱导α4整合素二聚化所必需的。

FAK和Rhofamily（RhoA、Rac1和Cdc42）是由整合素激活并促进细胞迁移的关键信号分子。正常T细胞中，发热会上调FAK-Tyr397的磷酸化并诱导RhoA的活化。而在Itga4R985A/R985A T细胞中，FAK和RhoA均未被热应激激活，表明热应激诱导的FAK和RhoA活化依赖于Hsp90-α4结合。此外，Hsp90诱导的FAK和RhoA活化依赖于α4整合素二聚化。表达Hsp90-NM（不能诱导α4二聚化）的T细胞中FAK和RhoA的活化减少，表明Hsp90-NM可能与内源性Hsp90竞争结合α4整合素并因此抑制基础Hsp90-α4结合及其下游信号传导。

图9.  Hsp90-α4结合激活FAK-RhoA GTP酶途径。

• Hsp90-a4相互作用的破坏会损害发热诱导的T细胞运输

利用全身热疗（whole-body hyperthermia，WBH，core temperature 39.5℃ ± 0.5℃）分别处理野生型和Itga4R985A/R985A点突变小鼠，来研究热应激过程中Hsp90-α4轴在T细胞运输中的作用。WBH处理的WT小鼠Hsp90表达上调、T细胞中Hsp90-a4结合增强。而Itga4R985A/R985A点突变小鼠中Hsp90-a4结合没有改变，也没有观察到WBH诱导的T细胞粘附和迁移。检测各种淋巴组织中T细胞的分布，结果发现，在WT小鼠中，在WBH处理后外周淋巴结（PLN）、肠系膜淋巴结（MLN）、PP结（PP）中T细胞积累增加，脾和外周血（PB）中的T细胞降低。由于缺乏HEV结构，脾脏中的T细胞分布几乎没有改变。相反，在WBH处理后，Itga4R985A/R985A点突变小鼠中PLNs，MLNs和PPs中T细胞分布的变化明显不如WT小鼠，表明Hsp90-α4结合被破坏后会显著抑制热应激诱导的T细胞向这些淋巴结的运输。

图10. 破坏Hsp90-a4相互作用抑制热应激诱导的T细胞体内迁移

注射LPS将小鼠体温升高至约38℃，持续少于6小时。这样的体温升高并未改变小鼠中的Hsp90表达或T细胞分布。体外实验显示，在38.5℃及以上处理的T细胞中Hsp90表达上调，但在38℃处理的细胞中没有表达。因此，诱导Hsp90表达和促进T细胞运输需要38.5°C或更高的发烧温度。

图11.  LPS诱导的中度发热不会影响小鼠的T细胞运输

通过建立鼠伤寒沙门氏菌感染的小鼠模型，导致食物和水传播的肠胃炎和伤寒，来评估Hsp90-α4轴在与高热相关的病理过程中的作用。鼠伤寒沙门氏菌感染在Itga4R985A/R985A点突变小鼠中导致比在WT小鼠中更严重的致死性、更严重的肠组织损伤并且在小肠（SI）中的细菌传播显著增加。野生型小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌后小肠（SI）、外周淋巴结（PLN）和脾中的T细胞增加，并且肠系膜淋巴结（MLN）、PP结（PP）和外周血（PB）中的T细胞减少。而在Itga4R985A/R985A点突变小鼠中，Hsp90-α4结合被破坏则显著抑制了PLN中T细胞分布的变化，SI中T细胞显著减少，表明Hsp90-α4结合一旦被破坏会抑制细菌感染期间T细胞向发炎组织的募集。这些结果说明，发热会增强Hsp90-α4轴，这对于促进免疫细胞运输到发炎组织和促进细菌感染的清除至关重要。

图12.  破坏Hsp90-α4相互作用还削弱了细菌感染的清除。

发热可以通过热休克蛋白90（Hsp90）诱导α4整合素活化并激活细胞迁移相关信号通路，从而促进免疫细胞迁移到淋巴结和炎症部位。

其具体机制为：发热会上调T细胞中Hsp90的表达并促进其与α4整合素胞内区结合。Hsp90-α4整合素的结合一方面通过inside-out信号通路激活α4整合素；另一方面，一个Hsp90分子可以通过其N端和C端结构域同时结合两个α4整合素分子，从而引起α4整合素在细胞膜表面的二聚化和聚簇现象，并激活胞内FAK-RhoA信号通路，最终促进T细胞迁移。通过构建α4整合素R985A突变基因敲入小鼠在体内破坏Hsp90-α4整合素结合后，会抑制发热所诱导的T细胞向引流淋巴结的迁移，并严重影响T细胞对病原菌感染的清除。此外，研究也发现该机制同样适用于发热调控其他α4整合素表达阳性的免疫细胞（如单核细胞、B细胞等）的定向迁移，说明该机制适用于多种固有免疫与适应性免疫细胞。

图13. 发热通过Hsp90-α4整合素热感应信号通路促进T淋巴细胞迁移

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