策略1 Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1 非肌细胞对成体心脏中的肌细胞没有贡献

使用Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠来同时追踪成体心脏中的心肌细胞和非心肌细胞。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色显示tdTomato+细胞是TNNI3+心肌细胞，而ZsGreen+细胞不是TNNI3+心肌细胞（图1G）。 分离Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1的心肌细胞进行体外观察也没有检测到ZsGreen+心肌细胞（图1H）。 因此，Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1系统用两种不同的荧光标记了肌细胞和非肌细胞（图1I）。

图1.G-I

非肌细胞在成体心脏中是否会分化成肌细胞呢？如果是，那么源自非肌细胞的新心肌细胞将是ZsGreen+的。而实验结果是：在Dox诱导后，对Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠进行结扎左前降支冠状动脉诱导MI造模（图2A）。心肌梗塞后，造成心肌细胞大量死亡，心脏功能受损，在损伤后2-4周，对心脏切片进行ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，结果没有发现ZsGreen+TNNI3+的心肌细胞（图2B）。在5个心梗组织的600多个切片中，都没有检测到ZsGreen+tdTomato-心肌细胞。流式细胞分析（图2D）和荧光显微镜（图2E）也证实在Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的MI造模后的心脏中也没有观察到ZsGreen+心肌细胞。RT-PCR结果也只有tdTomato的表达，没有ZsGreen的mRNA表达（n=5，图2F）。这些数据表明，非心肌细胞在成体心脏的心脏损伤后对肌细胞没有贡献。

图2. A-F

平行地，将骨骼肌损伤后骨骼肌中非肌细胞向肌细胞的细胞命运转化作为阳性对照。骨骼肌在稳态维持过程中，肌纤维细胞与非肌肉细胞发生融合，肌纤维细胞处于多核状态，因此在正常骨骼肌（假手术组）中，可以检测到tdTomato+ ZsGreen+肌细胞（图2G）。而当对Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的胫骨前肌（TA肌）实施BaCl2损伤后，骨骼肌中肌纤维细胞大量死亡，TA肌损伤后可以检测到弱tdTomato荧光信号和强ZsGreen表达，表明在BaCl2造模后ZsGreen+细胞逐渐取代tdTomato+细胞（图2G）。与假手术组相比，在受损TA肌中可以检测到ZsGreen+tdTomato-肌细胞（箭头，图2G），说明非肌细胞重新形成肌细胞。

图2. G

综合上述结果，通过Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1（策略1）的双同源重组谱系示踪技术揭示了在胚胎心脏和成体骨骼肌中非肌细胞向肌细胞的转化，但在成体心脏中非肌细胞对肌细胞没有贡献。

策略2 Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3 反向Cre/Dre 系统在非肌细胞向肌细胞转化研究中标记两种细胞

设计第2个双同源重组谱系示踪系统用来验证非肌细胞向肌细胞的转化。该系统由Tnnt2-Cre（肌细胞中表达Cre）、他莫昔芬诱导型 R26-DreER 和IR3报告小鼠组成。利用IR3报告小鼠（见下图）可排它性地将非肌细胞标记上tdTomato红色荧光，将肌细胞特异性地标记上ZsGreen绿色荧光。

Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠就可以同时标记肌细胞（ZsGreen+）和非肌细胞（tdTomato+）（图3A）。 

图3. A

胚胎E8.0天心脏中ZsGreen主要标记原始心管（图3B）。E8.0天给予他莫昔芬诱导，在E13.5天的右心室中发现tdTomato+非肌细胞对肌细胞有显著贡献（图3C）。心脏切片免疫染色也证实了此结果（图3D-F）。

同样，在成体心脏和骨骼肌中，通过MI和BaCl2造模来观察非心肌细胞的命运转化（图3G）。分离的心肌细胞的流式细胞分析（图3H）和荧光显微镜（图3I）分别结果也都显示没有tdTomato+心肌细胞。在形态上，这些tdTomato+细胞与ZsGreen+心肌细胞也明显不同（图3J）。 

tdTomato和TNNI3免疫染色显示这些tdTomato+细胞在MI心脏的梗塞区、边界区和远端区均不会转化为TNNI3+心肌细胞（图3K）。来自5个Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠心脏的超过600个组织切片中均未检测到tdTomato+TNNI3+心肌细胞。RT-PCR结果也同样指出分离的心肌细胞只表达ZsGreen，不表达tdTomato（图3L）。

相反，在阳性对照实验中，TA肌损伤模型中他莫昔芬诱导后可以很容易地检测到tdTomato+ZsGreen-肌细胞（箭头，图3M），而假手术组没有。

图3. 

综合上述结果，第2种策略使用Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3也显示出与策略1一致的结果：非心肌细胞在胚胎心脏和成体骨骼肌中转化为肌细胞，但在成体心脏中对肌细胞没有贡献。

策略3 Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1

为了进一步验证上述发现，使用另一种肌细胞Marker——TNNI3来驱动Dre重组酶。 Tnni3-Dre在成体心脏中有效且特异性标记肌细胞，但不标记非肌细胞。利用Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1小鼠，分别标记肌细胞和非肌细胞（图4A）。

图4. A

通过ZsGreen、tdTomato和不同心脏细胞谱系marker的免疫染色显示肌细胞表达tdTomato、非肌细胞（例如内皮细胞、成纤维细胞等）表达ZsGreen（补充材料）。不给予Dox诱导的情况下，在Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1小鼠中未观察到ZsGreen+细胞组织（图4B）。

给予Dox后两周，进行MI或BaCl2注射（图4C），结果发现在假手术的心脏中，Dox诱导后使tdTomato+心脏细胞也被标记上ZsGreen绿色荧光（图4D）。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色显示所有心肌细胞均为tdTomato+ZsGreen-（图4E）。MI造模后，梗塞的心脏组织中tdTomato+肌细胞数量明显减少，被ZsGreen+非肌细胞替代（图4F）。

分离MI造模后的心肌细胞体外观察均为tdTomato+ZsGreen-细胞（图4G）。 tdTomato、ZsGreen和TNNI3免疫染色显示ZsGreen+细胞在损伤后并没有转向心肌细胞命运（图4H，I）。通过分流式细胞分析和RT-PCR没有检测到MI心脏中有任何ZsGreen+tdTomato-肌细胞（图4J，K）。

相反，在阳性对照实验中，在损伤的TA肌肉中可以检测到ZsGreen+tdTomato-肌细胞（箭头，图4L），表明非肌细胞新生为肌细胞。

图4. 

所以，基于Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1的第3种模型也揭示了在成体心脏中非肌细胞并不转化为肌细胞。

策略4 Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1 通过NR1系统研究非肌细胞向肌细胞的转化

虽然利用广泛型启动子驱动的可诱导Cre或Dre可以有效标记大多数非肌细胞，但实际上标记效率并未达到100％。少数未标记的非肌细胞在损伤后在成体心脏中产生新的肌细胞也仍旧是有可能的，虽然可能性并不大，因为在谱系示踪期间的标记过程是完全随机的。为了达到100％的非肌细胞标记效率，利用NR报告基因小鼠（见下图），设计了第4种策略。

在这个系统中，ZsGreen标记小鼠所有的细胞，除了被tdTomato标记的新形成的肌细胞。Actb-Cre-loxP重组之后NR1小鼠中的所有细胞首先被标记为ZsGreen绿色荧光，只有新的肌细胞在形成时由于第二个Tnnt2-Dre-rox的重组而开启tdTomato红色荧光的标记（图5A）。绿色荧光蛋白在哺乳动物细胞中有12-24小时的半衰期，所以尽管肌细胞中的Dre-rox重组会导致tdTomato表达，但ZsGreen蛋白在降解前仍有稳定的标记时间。因此可以在非肌细胞向肌细胞转化期间检测到双阳性细胞。

图5. A

首先分析之前实验中的胚胎心脏（图5B）来测试这个系统。很容易在E8.5天发育的心脏流出道中检测到tdTomato+ZsGreen+肌细胞（箭头，图5C），这与以前的研究结果一致，表明第二心区祖细胞在这个阶段分化成心肌细胞。

然后，在MI造模28天期间每12小时间隔收集小鼠心脏样本进行分析（图5B）。对于ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，结果显示在梗塞心肌中没有ZsGreen+tdTomato+肌细胞（图5D）。所有56个时间点的Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心脏样本，超过6000个心脏切片中未检测到任何ZsGreen+tdTomato+肌细胞。类似地，分离心肌细胞进行流式细胞分析在ZsGreen+细胞中也没有发现肌细胞（图5E）。

相反，阳性对照实验中很容易在受损TA肌肉中检测到ZsGreen+tdTomato+肌细胞（图5F）。在Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心脏切片中非肌细胞100%被ZsGreen标记（补充材料）。

图5.

综上所述，使用基于Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1的第4种谱系示踪策略的结果显示，非肌细胞向肌细胞的转化只在胚胎期而不在成体心脏中出现。