小胶质细胞是位于大脑中的巨噬细胞，主要负责中枢神经系统 (CNS) 的免疫防御，对维持大脑内稳态有着重要作用。

然而，由于缺乏合适的研究工具，当前的研究方法很难区分小胶质细胞及脑内其它巨噬细胞，因此，人们对小胶质细胞功能机制的深入研究受到了一定的限制。

之所以很难区分小胶质细胞及脑内其它巨噬细胞，是因为这些巨噬细胞同源，许多标记物都相同，如整合素 α M (ITGAM/CD11b)、表面糖蛋白 F4/80、造血标志物CD45、溶酶体蛋白CD68、离子钙接头分子（Iba）-1， Cx3趋化因子受体1（Cx3cr1）、MER原癌基因酪氨酸蛋白激酶（MerTK）等。

事实上，早前出现的Cx3cr1-Cre和Cx3cr1-CrERT2品系都是标记所有CNS巨噬细胞，并不能区分小胶质细胞和脑内其它巨噬细胞。

因此，使用Cx3cr1-GFP、Cx3cr1-Cre或Cx3cr1-CrERT2品系通常将CNS中所有巨噬细胞的混合体作为整体进行评估，而不是只针对小胶质细胞这一类进行研究。

此外，现有的转基因品系如Sall1-GFP、Sall1-CreERT2、Cx3cr1-GFP、Cx3cr1-Cre或Cx3cr1-CreERT2通常是替代性敲入策略产生的，即表达外源性敲入的序列，内源性基因不表达，但是该类策略有可能会影响小胶质细胞的表型，因此，迫切需要新的基因工具来对小胶质细胞进行研究。

为此，南模生物自主研发，构建了一种新的小胶质细胞基因靶向模型，Tmem119-CreERT2工具小鼠，该小鼠可用于特异性研究小胶质细胞的功能。

早在2016年，斯坦福大学医学院Mariko L. Bennett等人在顶尖杂志PNAS发表了一篇文章，对小胶质细胞的特异性标志物进行了深入探究。

作者筛选出7个（Tmem119、Fcrls、P2ry12、P2ry13、Gpr34、Gpr84、Il1a) 候选基因，通过原位杂交，发现TMEM119特异性在鼠源和人源的小胶质细胞上大量表达（Fig1），在脉络膜丛和脑膜巨噬细胞，血管周围细胞中均没有表达。

另外，qPCR结果显示TMEM119在CNS CD45+细胞中高表达，在骨髓、脾脏、肝脏和血液中不高表达。

所有这些数据表明：TMEM119在小胶质细胞中高表达且仅限于小胶质细胞，TMEM119确实可以作为小胶质细胞高度特异性的marker。随后，TMEM119抗体被广泛用作免疫组化方法的金标准。

Fig1. 免疫荧光检测TMEM119在小胶质细胞中特异性表达。

2019年，Tobias Kaiser等通过CRISPR/Cas9技术插入2A-EGFP基因盒，使得TMEM119和EGFP的表达受到内源性Tmem119基因的控制，利用免疫荧光染色、免疫荧光成像等技术对小鼠脑组织中表达EGFP的细胞进行分析，结果发现：除小胶质细胞外，脉络膜丛和脑膜巨噬细胞，血管周围细胞中均没有EGFP的表达（Fig2. A-F）。

为了进一步验证EGFP在小胶质细胞中的特异性，作者使用了流式细胞术，通过检测CD45+EGFP+细胞，他们确定99.6% 的细胞是对应于小胶质细胞的CD11b+CD45lo细胞(Fig2. H)。对2212个非小胶质细胞CD11b+CD45int/hi进一步检测，发现仅有153个细胞表达EGFP(6.9%)( Fig2. G-I)。

综上数据表明，Tmem119-EGFP可以特异性的区分小胶质细胞和脑内其他巨噬细胞。

Fig2. Tmem119-EGFP 可特异性区分小胶质细胞及脑内其它巨噬细胞。

此外，Tobias Kaiser等科学家还证明Tmem119位点可被用于Tamoxifen诱导Cre介导的小胶质细胞基因操作和小胶质细胞的谱系追踪，且可排除其它巨噬细胞的影响。

作者将Tmem119-CreERT2小鼠与Ai14报告小鼠进行杂交，经Tamoxifen处理后，对小鼠进行免疫荧光染色。

结果发现，Tamoxifen诱导后，IBA1标记的小胶质细胞会表达红色荧光 (Fig3. B-D)，未经Tamoxifen诱导的小鼠则没有tdTomato表达 (Fig3.E-G)。

另外研究还发现，中枢神经系统的其他主要细胞类型，如少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞中都没有tdTomato表达 (Fig3.H-J)。

Fig3. Tmem119-CreERT2小鼠在小胶质细胞中具有高效的重组效率。

我们利用CRISPR/Cas9技术在Tmem119基因的终止密码子前插入了2A-CreERT2基因盒，使得Cre重组酶具有Tmem119启动子特异性，且需要tamoxifen的存在才能激活。

通过将Tmem119- CreERT2与荧光报告基因小鼠基因交配发现，Tamoxifen诱导的Tmem119- CreERT2系可以在很长一段时间内对小胶质细胞产生稳定的遗传修饰。

为了评估Tmem119-CreERT2小鼠诱导后在小胶质细胞中是否有Cre活性，我们将Tmem119-CreERT2小鼠与R26-LSL-tdTomato报告小鼠进行杂交。

实验表明：无Tamoxifen诱导的对照组中，检测不到tdTomato的表达，只有经Tamoxifen诱导后，小胶质细胞才能够表达tdTomato（Fig4. A-B）。

此外，在少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞中都检测不到tdTomato表达（Fig4. C-D），该结果与已有报道的信息是相符的，提示该小鼠是研究小胶质细胞研究的有力工具鼠。  

Fig4. Tmem119-CreERT2小鼠在小胶质细胞中具有高表达。

A. 经Tamoxifen和玉米油分别处理，荧光检测Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠中tdTomato的表达情况。

B. 荧光检测Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠IBA1 阳性细胞中有tdTomato的表达。

C. 荧光检测Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠小胶质细胞（Tmem119，Tdtomato）与星形胶质细胞（GFAP, green）共定位。

D. 荧光检测Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠小胶质细胞（Tmem119，Tdtomato）与神经元（NeuN, green）共定位。

（Scale bar=10μm Hippo: Hippocampus; Str: Striatum; Sn: Substantia nigra.)

综上所述， Tmem119在小胶质细胞高度特异性表达的特性，使其可作为区别于遗传特征相近的CNS髓细胞和外周血中的髓细胞的marker基因/

本文构建的可诱导的Tmem119-CreERT2是一个很好的体内模型，可以在特定的时间点对小胶质细胞特异性基因进行研究，为探索小胶质细胞开辟了新的途径。

目前该小鼠是活体供应的状态，欢迎研究小胶质细胞功能的老师咨询及订购。