2018年2月16日，Cancer Cell 发表了军事医学研究院生物工程研究所叶棋浓课题组的最新科研成果“Transcriptional Regulation of the Warburg Effect in Cancer by SIX1”，首次将miR-548a-3p/SIX1轴与Warburg效应和肿瘤生长联系起来，并阐明了相关作用机制。

此项研究发现：

• SIX1是新的Warburg 效应的关键转录因子

• SIX1通过 HBO1和AIB1 增强 Warburg 效应

• SIX1糖酵解功能直接被 microRNA548a-3p 抑制

• miR-548a-3p / Six1轴调节 Warburg 效应和肿瘤生长

研究背景

1956年，德国生理学家Warburg发现了肿瘤细胞的一种异常代谢。正常细胞中，葡萄糖会维持一个平衡状态，在缺氧状态时，葡萄糖会转变为丙酮酸进而转变为乳酸，当氧含量正常时，丙酮酸会进入线粒体，参与三羧酸循环并产生大量能量。而在癌细胞或其他高度增殖的细胞类型中，即使在常氧环境下，也不利用线粒体氧化磷酸化产能，而是利用有氧糖酵解，在胞质中酵解形成大量乳酸，这就是“Warburg效应”。

图1. Myc和HIF-1调节葡萄糖代谢并刺激Warburg效应 （图片来自Clin Cancer Res. 2009 Nov 1; 15(21): 6479–6483）。

以有氧糖酵解的形式在肿瘤发生发展过程中起着重要作用，通过这种异常能量代谢，肿瘤细胞可以逃避正常的细胞凋亡程序，进行增殖和迁徙，因此Warburg效应是癌症的一个重要标志，人们正在致力于研发针对Warburg效应的抗肿瘤药物。

已经发现转录因子HIF-1a和c-Myc是Warburg效应的关键调节因子。Myc和HIF-1调节（上图虚线表示）参与葡萄糖代谢的基因（葡萄糖转运蛋白Glut1，HK2，PKM2，LDHA和PDK1），有利于葡萄糖转化为乳酸（糖酵解）。Myc也通过调节转运蛋白（SLC1A5）和谷氨酰胺酶（GLS）来刺激谷氨酰胺代谢。谷氨酰胺通过脱氨基作用变成α-酮戊二酸（α-KG），从而进入三羧酸循环，分解代谢成苹果酸，被转运到细胞质并转化为丙酮酸，然后转化为乳酸盐（谷氨酰胺分解）。 PDH，丙酮酸脱氢酶。

不过，目前只有为数不多的几个转录因子被报道参与了Warburg效应的调控，因此，人们对Warburg效应的转录调控机制仍知之甚少。

研究成果

• SIX1是Warburg效应的关键转录因子

对SIX1稳定敲低（KD）的乳腺癌细胞系ZR75-1及对照细胞系进行转录组测序（RNA-seq）分析以及Realtime RT-PCR验证，发现SIX1敲低后一系列糖酵解通路相关基因的表达发生了改变；类似的，SIX1敲除（KO）乳腺癌细胞系ZR75-1和SIX1 KD肝癌细胞系HepG2中糖酵解关键基因（GLUT1、HK2、PFKL、ALDOA、GAPDH、PGK1、ENO1、PKM2、LDHA）均显著下调；重新表达SIX1可以拯救这些变化。同样，在体内实验中，Six1 KO小鼠的成纤维细胞（MEFs）、胚胎、肝脏、小肠、肺组织中也检测到相似结果（图2）。提示了SIX1是调节糖酵解基因表达的关键因子。

图2. Six1 KO小鼠胚胎及相关组织中糖酵解基因表达变化

• SIX1通过结合SIX1响应元件促进糖酵解基因表达

早前研究提示SIX1的DNA结合位点具有TCAG/TG特征序列，而且SIX1直接与6个糖酵解基因（PFKL, ALDOA, PGK1, ENO1, PKM2和LDHA）的启动子结合。因此，为研究SIX1如何调控糖酵解基因的转录，利用荧光素酶报告基因系统，将受调控的糖酵解基因启动子区域约3 kb的范围内含有SIX1结合位点的序列作为启动子，观察SIX1是否激活荧光素酶的表达（图3A）。利用染色质免疫共沉淀（ChIP）也进一步证实了SIX1调控糖酵解基因的转录是通过结合于它们的启动子来实现的（图3B）。

图3. SIX1通过结合于带有SIX1响应元件的启动子来促进糖酵解基因表达

• SIX1促进糖酵解基因转录主要是通过HBO1和AIB1介导的组蛋白乙酰化

基因转录调控需要转录因子与组蛋白修饰酶的相互作用，而组蛋白乙酰化通常与转录激活相关。利用免疫共沉淀（CoIP）结合质谱法，筛选出两个与SIX1相互作用的组蛋白乙酰转移酶——HBO1与AIB1。利用HBO1和AIB1 KO、KD细胞系发现，HBO1 KO或KD细胞系中HK2, ALDOA, PGK1, ENO1 和 LDHA基因表达下调；AIB1 KO或KD细胞系中GLUT1, PFKL, ENO1, PKM2, 和 LDHA表达下调。重要的是，HBO1/AIB1 KO 或 KD后，SIX1对糖酵解基因的激活能力显著降低或消失了。说明SIX1调控糖酵解基因的表达需通过与HBO1和AIB1的相互作用实现（图4A-D）。

那么SIX1是如何通过HBO1和AIB1调控糖酵解基因的呢。通过ChIP实验发现，SIX1促进糖酵解基因的转录是通过HBO1介导的H4K5乙酰化和AIB1介导的H3K4乙酰化实现的（图4H）。

图4. SIX1促进糖酵解基因转录主要是通过HBO1和AIB1介导的组蛋白乙酰化

• SIX1被miR-548a-3p抑制，从而下调糖酵解基因表达

接下来要寻找上游调控SIX1的microRNAs。通过靶点预测，筛选到若干潜在的SIX1靶向miRNAs，其中只有miR-548a-3p能够直接特异地抑制SIX1蛋白表达，并且降低受SIX1调控的糖酵解基因的表达。如果敲除SIX1基因，则miR-548a-3p对糖酵解基因的抑制作用也随之消失。说明miR-548a-3p通过SIX抑制糖酵解基因的表达（图5）。

图5. miR-548a-3p通过SIX抑制糖酵解基因的表达

• 体外实验表明miR-548a-3p/SIX1轴调节有氧糖酵解，影响肿瘤细胞扩增

miR-548a-3p mimics降低了肿瘤细胞的葡萄糖摄取、丙酮酸、乳酸及ATP水平、细胞外酸化率（ECAR）以及细胞有氧呼吸消耗速率（OCR）。SIX1敲除后，细胞的这些糖酵解表型变化消失，说明miR-548a-3p通过SIX1基因行使抑制糖酵解表型的功能。HBO1/AIB1 KO或KD后，SIX1对这些糖酵解表型的调节功能受到严重影响，说明SIX1需要依靠HBO1和AIB1来发挥调节作用。（图6A-L）

miR-548a-3p mimics抑制了肿瘤细胞的增殖。糖酵解抑制剂（2-DG和3-BP）抑制了肿瘤细胞的增殖，降低了anti-miR-548a-3p 和 SIX1 对肿瘤细胞增殖的促进作用。（图6M-O）

图6. 体外实验表明miR-548a-3p/SIX1轴调节有氧糖酵解，影响肿瘤细胞扩增

• miR-548a-3p/SIX1轴在体内同样调控有氧糖酵解及肿瘤细胞扩增

在裸鼠异种移植瘤模型中，利用18FDG标记的小动物PET技术检测肿瘤的糖摄取能力，发现miR-548a-3p通过SIX1调节糖摄取，而SIX1通过HBO1和AIB1发挥作用（图7A-E）。通过糖酵解抑制剂2-DG或敲低LDHA糖酵解酶抑制糖酵解过程后，肿瘤生长和乳酸水平都显著受到抑制。更重要的是，糖酵解抑制剂2-DG或敲低LDHA糖酵解酶消除了anti-miR-548a-3p和SIX1对肿瘤生长及乳酸水平的刺激作用，说明miR-548a-3p/SIX1轴介导的糖酵解对于肿瘤细胞的生长非常关键（图7F-I）。

在Six1基因敲除小鼠胚胎中糖摄取及乳酸水平均显著下降（图7J）。而糖摄取增加的乳腺癌患者肿瘤样本中的miR-548a-3p表达下调，SIX1表达上调（图7K）。

图7. miR-548a-3p/SIX1轴在体内同样调控有氧糖酵解及肿瘤细胞扩增

• 临床肿瘤相关SIX1基因突变会促进糖酵解基因表达、有氧糖酵解以及肿瘤生长

临床研究发现，在肿瘤中存在SIX1基因的Q177R突变。为研究该突变与糖酵解基因表达的关系，在SIX1基因敲除的肿瘤细胞系以及Six1基因敲除小鼠的MEF细胞中检测糖酵解基因的表达情况，发现相关糖酵解基因（HK2, GAPDH, PKM2 和 LDHA)表达上调。利用ChIP实验证明SIX1（Q177R）突变后，其被招募到HK2和LDHA基因启动子上的信号较野生型SIX1更强，对启动子的激活能力更强。（图8A-E）

SIX1（Q177R）突变体在体外实验中增加了糖摄取、丙酮酸水平、乳酸产生以及ATP水平。SIX1敲除的肿瘤细胞在导入SIX1（Q177R）突变体后，与导入野生型SIX1相比，生长更为旺盛。SIX1（Q177R）突变后，HK2和LDHA的表达水平也更高。（图8F-J）

图8. 临床肿瘤相关SIX1基因Q177R突变会促进糖酵解基因表达、有氧糖酵解以及肿瘤生长

• miR-548a-3p/SIX1轴在乳腺癌中的临床相关性

对乳腺癌患者标本进行检测以及数据库分析发现，miR-548a-3p表达与SIX1基因表达负相关、与PGK1、LDHA等糖酵解基因也成负相关，SIX1与糖酵解基因表达成正相关（图9A）。SIX1被发现在多种肿瘤中有过表达，比如：超过50%的乳腺癌患者、超过60%的肝癌患者中SIX1高表达。但是miR-548a-3p表达在临床肿瘤中的情况尚不清楚。此研究发现乳腺癌肿瘤组织中miR-548a-3p是显著下调的，与肿瘤体积、淋巴结状态、肿瘤分级成负相关。另外，miR-548a-3p表达高的患者预后比较好。（图9B-C）

图9. miR-548a-3p/SIX1轴在乳腺癌中的临床相关性

总结

SIX1是Warburg 效应的关键转录因子。在缺氧条件下，miR-548a-3p表达被抑制，使下游靶基因SIX1活化，而SIX1通过与组蛋白乙酰转移酶HBO1和AIB1相互作用，激活一系列糖酵解基因表达，进而影响调控细胞糖酵解过程，最终促进细胞恶性转化及癌症发生。这一发现为新的抗肿瘤药物研发提供了新的靶点与思路。

图10. miR-548a-3p / SIX1 / HBO1 / AIB1轴在肿瘤生长中的作用模式图

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