2017年10月20日，Cell Research 在线发表了中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所神经科学国家重点实验室熊志奇研究组的研究论文“PRRT2 deficiency induces paroxysmal kinesigenic dyskinesia by regulating synaptic transmission in cerebellum”，报道了小脑和运动障碍研究进展，详细而系统地揭示了 PRRT2 在脑内的表达和功能，首次体内实验确认了 PKD 发病的 PRRT2功能缺失机制，揭示了 PRRT2 在突触 SNARE 复合体形成和囊泡释放中的重要调节作用和阵发性运动诱发性运动障碍的神经环路原理。

为研究 Prrt2 基因在细胞囊泡运输和调控中的作用，研究人员利用 Prrt2 条件性基因敲除（Prrt2 flox）小鼠模型，通过与不同组织特异性 Cre 工具鼠交配以及病毒介导的 Cre-loxp 系统，制备了一系列的 Prrt2 基因突变小鼠，涵盖脑内条件性性基因敲除、小脑内局部基因敲除、小脑颗粒细胞内条件性基因敲除等。多年来，PKD研究中存在的条件限制是缺乏有效的动物模型，该研究首次制备了小鼠PKD模型，为后续开展药物开发或干预治疗探索提供了稳定可靠的动物疾病模型。

研究背景

PKD 是严重的中枢神经系统疾病，一种反复发作、运动诱发、持续时间短暂的运动障碍病，临床上表现为舞蹈症，手足徐动症，投掷症，肌张力障碍或这些运动失调症状的组合，发作时没有意识丧失，多发于青少年时期。其确切的发病机制一直不明。

2011年，熊志奇研究组与复旦大学华山医院教授吴志英、福建医科大学教授王柠课题组合作，发现了 PKD 首个致病基因 PRRT2。作为第一个被鉴定出来的 PKD 致病基因，PRRT2 在体内的生物学功能以及如何调控运动功能仍是亟待研究解决的问题。

研究中所用小鼠模型

• Prrt2stop 小鼠：利用 Crispr-Cas9 技术，在小鼠 Prrt2 基因 c.666位置插入两个终止密码子 TAGTAA，导致小鼠 Prrt2 基因在跨膜结构域之前提前终止，来模拟 PKD 病人 PRRT2 基因 c.649位置热点致病突变。

Fig1.  Prrt2stop 小鼠构建策略。

• Prrt2 flox 小鼠：利用经典 ES 细胞打靶技术，将 loxp 位点通过同源重组整合到 Prrt2 基因编码主要结构域的 exon2 两侧。该品系由上海南方模式生物构建。

Fig2.  Prrt2 flox 小鼠构建策略。

• Nestin-Cre;Prrt2−/−：中枢神经系统神经元条件性敲除 Prrt2 基因

Fig3.  Nestin-Cre;Prrt2−/− 小鼠原理示意图。

• CaMKIIα-Cre;Prrt2−/−：前脑（包括运动皮质与纹状体）条件性敲除 Prrt2 基因

• GluN2C-Cre;Prrt2−/−：小脑颗粒细胞（GCs）条件性敲除 Prrt2 基因

• GluN2C-Cre;Ai32+/−;Prrt2−/−：小脑颗粒细胞敲除 Prrt2 基因的同时表达光遗传通道蛋白CHR2 [Ai32：ChR2(H134R)-EYFP] 。

Fig4.  GluN2C-Cre,Ai32+/-;Prrt2−/− 小鼠原理示意图。

• AAV-Cre;Prrt2−/−：小脑蚓部立体定向注射 Cre 腺病毒(AAV-Cre-GFP)，小脑局部敲除 Prrt2 基因

研究结果

• Prrt2 定位于突触前膜和小囊泡中。

Fig5.  Prrt2 亚细胞定位。

• Prrt2 与突触蛋白 Syntaxin1A 及 SNAP25 相互作用，抑制神经元突触内 SNARE 蛋白复合体的形成，从而调控囊泡入坞到突触前膜的过程。

Fig6.  Prrt2 影响 SNARE 复合体形成，调控囊泡入坞到突触前膜的过程。（A-B）Prrt2stop 小鼠中 PRRT2 蛋白缺失；（C-D） PRRT2 与 STX1A 及 SNAP25 相互作用；（E-F）Prrt2 缺失导致突触小体中 SNARE 蛋白复合体增多；（G-H）Prrt2 缺失导致入坞到突触前膜的囊泡数量增多。

• Prrt2 缺失致使突触易化。

Fig7.  Prrt2stop 小鼠中 PRRT2 蛋白缺失上调了小脑中 PF-PC 突触短时程易化。

• Prrt2stop 小鼠和 Nestin-Cre;Prrt2−/− 小鼠 都表现出运动失调。

Fig8.  Nestin-Cre;Prrt2−/− 小鼠 Prrt2 在前脑和小脑中表达缺失及表型分析。

• Prrt2 基因缺失表现出与 PKD 类似的运动障碍。

Fig9.  Prrt2 缺失导致运动障碍。 （A-B）Prrt2stop 小鼠在点燃诱发癫痫发作后表现出严重的阵发性运动障碍。 （C-D）Prrt2stop 小鼠在戊四氮（PTZ）诱发癫痫发作后表现出严重的阵发性运动障碍。（E） Prrt2stop 小鼠在50摄氏度环境中热诱导阵发性运动障碍。 （F-G）中枢神经系统中条件性敲除 Prrt2 小鼠热诱导阵发性运动障碍发作。（H-J）利用光遗传学在 Prrt2stop 小鼠小脑中局部激活神经元兴奋可诱导非自愿运动障碍。

• 小脑是控制 Prrt2 相关运动障碍的关键脑区。

Fig10.  小脑是控制 Prrt2 相关运动障碍的关键脑区。（A-C）腺相关病毒介导 Cre 在小脑内局部敲除 Prrt2 表达，导致热诱导性运动障碍的发作。（D-H）仅在小脑颗粒细胞中条件性敲除 Prrt2 （GluN2C-Cre;Prrt2−/− 小鼠）出现运动学习能力降低和热诱导性运动障碍发作。（I-K）在小脑颗粒细胞缺失 Prrt2 的小鼠（GluN2C-Cre;Prrt2−/− ）中，利用光遗传手段刺激小脑局部兴奋可导致诱发性运动障碍的出现。（L-N）仅在前脑中敲除 Prrt2 的小鼠（CaMKIIα-Cre;Prrt2−/−），小脑中 Prrt2 正常表达，则几乎没有诱导性运动障碍的发生。

• Prrt2 缺失导致小脑颗粒细胞的平行纤维与浦肯野细胞之间的突触传递改变，造成浦肯野细胞异常放电，导致小脑功能紊乱和阵发性运动障碍。

Fig11.  Prrt2 缺失导致小脑浦肯野细胞放电异常。(A-C）小脑颗粒细胞中特异性敲除 Prrt2 基因同时特异性表达光敏感通道蛋白 ChR2（GluN2C-Cre;Ai32+/−;Prrt2−/−）。（D-E）全细胞电生理记录 Prrt2 缺失导致浦肯野细胞强直放电频率明显增加；在光刺激颗粒细胞后，浦肯野细胞放电显著增加。（F）利用拮抗剂阻断 GABAa 受体不影响光刺激后浦肯野细胞的放电；（G）而阻断谷氨酸受体则消除了 Prrt2 缺失后光刺激导致的放电。

该研究的重要贡献在于，详细而系统地揭示了PRRT2在脑内的表达和功能，首次在体确认了PKD发病的Loss of Function机制，揭示了PRRT2对突触SNARE复合体形成和囊泡上膜过程中的调节，确定了小脑尤其是小脑颗粒细胞在PKD发病过程中的核心作用，一定程度上解决了一直困扰该研究领域的关于PKD关键调控脑区和环路的争论，推进了人们对这一罕见病发病机制的认识，同时也为人们了解神经元突触囊泡转运的调控机制提供了新的启发。

Fig12.  研究发现总结模式图。小脑（远山形状）内的颗粒细胞（红灯笼）中的PRRT2缺失，引起平行纤维和浦肯野细胞（大树）的之间的突触传递异常，进而导致浦肯野细胞的放电异常（鞭炮），从而造成了运动障碍的出现。该病在青少年儿童中高发。

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